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第一节发酵液预处理与固液分离第二篇目标产品的分离与纯化第五章细胞破碎、蛋白质复性和固液分离一、发酵液的预处理为什么要对发酵液进行预处理？预处理的目的是什么？预处理有哪些方法？㈠、发酵液的基本特性•产物浓度低•具有极性•黏度大•表面张力大•性质不稳定㈡、预处理的目的⑴改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率；⑵尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）；⑶去除发酵液中的部分杂质，以利于后续各步操作。•加热•调节pH值•凝聚和絮凝•使用惰性助滤剂•使用反应剂㈢、发酵液预处理的方法加热——最简单和廉价的处理方法。•可降低发酵液的黏度；•除去某些杂蛋白；•降低发酵液的体积；•破坏凝胶状结构；注意：产品的热稳定性。1、发酵液预处理的方法—加热细胞的聚集作用高度依赖于pH值的大小，恰当的pH值能够促进聚集作用。一般用草酸或无机酸或碱来调节。eg.⑴味精生产⑵青霉素的提取（王静康等）2、发酵液预处理的方法—调pH凝聚和絮凝都是发酵液预处理的重要方法，其处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。3、发酵液预处理的方法—凝聚和絮凝这两种方法的特点是不仅能使颗粒尺寸有效增加，并且会增大颗粒的沉降或浮选速率，提高滤饼的渗透性或者在滤床过滤时产生较好的颗粒保留作用。应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两个概念，其具体处理过程也有差别，应该明确区分开来，不可混淆。凝聚指在投加的化学物质（如水解的凝聚剂：铝、铁的盐类或石灰等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成1mm大小块状凝聚体的过程。⑴、凝聚凝聚剂的作用对初始粒子表面电荷的简单中和；消除双电荷层（采用中性盐，如NaCl等）而脱稳；通过氢键或其他复杂的形式与粒子相结合而产生凝聚。电解质的凝聚能力可用凝聚值表示，即胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（mmol/L）。一般离子的价数越高，凝聚值越小，也就是说，凝聚能力越强。Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+絮凝指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。⑵、絮凝其中絮凝剂主要起桇桥作用，工业上使用到的有聚丙烯酰胺类衍生物、聚合铝盐、海藻酸钠、壳聚糖等，目前最常用的是聚丙烯酰胺类衍生物。絮凝效果与絮凝剂的类型、剂量、溶液pH、搅拌速度、处理时间等有关。图1絮凝剂添加量对絮凝液滤速的影响还有一种方法——混凝，它包括了凝聚和絮凝两个过程。混凝剂投加量必须适当。量不足，达不到应用的混凝效果；量过大，则会造成胶体复稳。⑶、混凝eg.《活性污泥/混凝法处理高含盐染料废水的实验研究》（鲁秀国等）水样的混凝处理中，有三个过程：①细小颗粒聚集作用使颗粒变大；②絮状颗粒对水溶性物质的吸附作用；③絮状颗粒对水中悬浮粒子的粘着作用。惰性助滤剂是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物质，用于扩大过滤表面的适用范围，使非常稀薄或非常细小的悬浮液在过滤时发生的快速挤压和介质堵塞现象得到减轻，易于过滤。4、发酵液预处理的方法—助滤剂助滤剂表面具有吸附胶体的能力，并且由此形成的滤饼具有格子型结构，不可压缩，滤孔不会被全部堵塞，可保持良好的渗透性，因此能大大提高过滤能力和生产效率，降低过滤成本。⑴、助滤剂的功能•在滤布上预涂一层助滤剂，作为过滤介质使用，待滤毕后与滤饼一起除去；•助滤剂按一定比例均匀地混入待滤的悬浮液中，然后一起进入过滤机，使其形成较松的滤饼，降低其可压缩性，让滤液可以顺畅流通。⑵、助滤剂的使用方法⑶、惰性助滤剂的材料硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的碳、炉渣、重质碳酸钙或这些材料的混合物。使用时，要根据目的产物、过滤介质及过滤情况来选择助滤剂的品种、助滤剂的粒度、用量。在发酵液中加入某些不影响目的产物的反应物，以消除发酵液中的某些杂质对过滤的影响，提高过滤效率。5、发酵液预处理的方法—反应剂发酵液中的杂质a.高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）b.杂蛋白在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力；在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清；在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。㈣、发酵液的相对纯化1、高价无机离子的去除方法1.Ca2+——草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀（注意回收草酸）；2.Mg2+——三聚磷酸钠，→形成三聚磷酸钠镁不溶性络合物；3.Fe2+——黄血盐，→普鲁士蓝沉淀。2、杂蛋白的去除方法蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中：在酸性溶液中带正电荷；在碱性溶液中带负电荷。在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。⑴、沉淀法在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。⑵.变性法①加热；②大幅度调节pH值；③加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。不足之处a.加热法只适合于对热较稳定的目的产物；b.极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；c.有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。①在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；②在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。⑶、吸附法二、固液分离过滤不但是传统的化工单元操作，而且是目前工业生产中用于分离细胞和不溶性物质的主要方法，其操作是迫使液体通过固体支承物或过滤介质，把固体截留，从而达到固、液分离的目的。㈠、固液分离—过滤法图2过滤介质的清除能力（以去除最小颗粒直径表示）过滤器的类型很多，在生物工艺中应用较广并具有工业意义的过滤器主要有以下两大类：•真空过滤器•压滤器固液分离—过滤法图3水平圆盘过滤器1—分配头2—螺旋输送器3—过滤盘图4水平回转翻盘式真空过滤器图5转鼓真空过滤机过滤机外涂有厚厚的一层硅藻土，水和酶可以渗透过去，而培养基和微生物却被黏着在硅藻土表面上。转鼓过滤机旋转的过程中，发酵液喷散开来。水和酶被吸进过滤机的中央，培养基和微生物则留在硅藻土表面，稍后用巨型刀片将硅藻土及附着其上的培养基及微生物一同去除。图6水平带式真空过滤器简图用于各种悬浮液的固液分离，适用范围广。应用于食品、环保、轻工、医药、化工、冶金、石油等工业。特别适用于大批量啤酒、白酒、葡萄酒、食用油等液体饮料的精滤或除菌过滤。图7板框过滤机滤饼传统的过滤cakeConventionalfiltration封头过滤的问题自动反冲洗过滤机过滤过程反冲过程如果料液给过滤介质表面一个平等的大流量冲刷，则过滤介质表面积累的滤饼就会减少到可以忽略的程度，而通过过滤介质的流速却比较小。这种过滤方式称为错流过滤或切向流过滤。现代的膜分离过程主要采用这种过滤方式，如微滤和超滤。图8微滤过程示意图，料液快速经过薄膜，以减少形成滤饼错流过滤与传统过滤的主要差别：•过滤介质——多孔的高分子或无机材质薄膜；•需用泵循环悬浮液，周期性的放料，且无干滤饼；•过滤器的几何形状不同。错流过滤的优点：•过滤收率高；•滤液质量好；•减少处理步骤；•对染菌罐易于处理也易进行扩大生产。离心法是利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的一项分离、浓缩或提炼操作。㈡、固液分离—离心法这种方法对于固体颗粒很小或液体黏度很大，过滤速度很慢，甚至难以过滤的悬浮液十分有效，对那些忌用助滤剂或助滤剂使用无效的悬浮液的分离，也能得到满意的效果。离心分离可分为三种形式：离心沉降离心过滤离心分离和超离心固液分离—离心法利用固液两相的相对密度差，在离心机无孔转鼓或管子中进行悬浮液的分离操作。利用离心力并通过过滤介质，在有孔转鼓离心机中分离悬浮液的操作。利用不同溶质颗粒在液体中各部分布的差异，分离不同相对密度液体的操作。当固体粒子在无限连续流体中沉降时，受到两种力的作用，一种是连续流体对它的浮力，另一种是流体对运动粒子的粘滞力。离心沉降的基本原理：固体沉降1、离心沉降由上式可知：重力场中固体粒子最终的沉降速率与粒子直径的平方成正比，与粒子和流体的密度差成正比，而与流体的黏度成反比。gdus182在离心力场中，重力加速度应换成离心加速度。这样，只要根据要求改变或提高，使粒子作快速旋转，就可获得比重力沉降或过滤时高得多的分离效果。可用离心分离因子Fr来定量评价。2218sdugFr2Fr表示了粒子在离心机中产生的离心加速度与自由下降的加速度之比；Fr越大，越有利于分离。在实践中常按Fr值的大小对离心机进行分类：Fr3000，为常速度离心机；Fr=3000~5000，为中速离心机；Fr5000为高速离心机；Fr=2*104~106为超速成离心机。图9离心沉降设备类型碟式离心机是沉降式离心机中的一种，用于分离难分离的物料（例如粘性液体与细小固体颗粒组成的悬浮液或密度相近的液体组成的乳浊液等）。碟式离心机可以完成两种操作：液-固分离（即低浓度悬浮液的分离），称澄清操作；液-液（或液-液-固）分离（即乳浊液的分离），称分离操作。以其结构紧凑，占地面积小，生产能力大等特点，因而在化工、医药、轻工、食品、生物工程以及交通运输部门都获得广泛应用。管式分离机是一种分离因数极高的离心分离设备，能澄清及分离流体物质，被应用于化学、生物化学、制药、血浆等研究领域。离心过滤是将料液送入有孔的转鼓并利用离心力场进行过滤的过程，以离心力为推动力完成过滤作业，兼有离心和过滤的双重作用。离心过滤的原理2、离心过滤图10离心过滤工作原理图11离心过滤设备（a）分批产式轴（b）分批卧式轴（c）连续锥形滤网（d）连续推送式图12HR活塞推料离心机HR（Z）活塞推料离心机是一种连续进料，分离后的滤饼从转鼓中间歇排出的过滤式离心机。该机生产能力大、可对滤饼进行充分洗涤，洗涤效率高、功耗低、干燥快、对晶粒的破坏小。适于分离固相颗粒≥0.25mm的结晶状或纤维状物料的悬浮液。根据物质的沉降系数、质量和形状不同，应用强大的离心力，将混合物中各组分分离、浓缩、提纯的方法称为超离心法。它在生物化学、分子生物学以及细胞生物学的发展中起着非常重要的作用。3、超离心法应用超离心技术中的差速离心、等密度梯度离心等方法，已经成功的分离制取各种亚细胞物质，如线粒体、微粒体、溶酶体、肿瘤病毒等。它已成为现代生物技术领域研究中不可缺少的实验室分析和制备手段。超离心技术中使用的也是无孔转鼓离心机，所以也属离心沉降。如果粒子在离心力场中作匀速运动，即代入离心速率工式并积分，可得到：超离心法的基本原理dtdru1222ln18rrdts由上式可知，在某一转速时，沉降一组均匀的球形颗粒所需要的时间与它们直径的平方以及它们的密度和悬浮介质的密度之差成反比，而与介质的黏度成正比。也就是说，当粒子直径和密度不同时，移动同样距离所需时间不同，在同样的沉降时间，其沉降的位置也不同，这就是“微分离心”的基础。图13各类超离心分离示意图滴加样品离心管蔗糖浓度生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。蔗糖密度梯度思考:1、发酵液为什么要进行预处理？有哪些具体的方法？2、凝聚与絮凝的区别是什么？3、什么是错流过滤？错流微滤与传统过滤相比有何优点？4