56反胶束萃取

第六节反胶束萃取萃取新技术之一、概述传统的萃取法难以应用于蛋白质的提取分离。分离对象的特性；萃取剂的问题。在这一背景下发展起来了一种新的萃取分离技术—反胶束萃取。1977年，瑞士Luisi等人首次提出用反胶束萃取蛋白质；到80年代，荷兰Van’tRiet和Dekker、美国Gokelen、Hatton首先进行了反胶束萃取蛋白质的研究。近年来该项研究已在国内外深入展开。该法的优点：成本低、溶剂可反复使用；萃取率和反萃取率都很高；有可能解决外源蛋白的降解问题；构成反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，可直接从整细胞中提取蛋白质和酶。反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。反胶束（reversedmicelle）是表面活性剂分散于连续有机相中一种自发形成的纳米尺度的聚集体。二、反胶束溶液形成的条件和特性表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子，可分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂。表面活性剂有机溶剂表面活性剂有机溶剂AOT[丁二酸-2-2乙基己基酯磺酸钠]n-烃类（C6~C10）、异辛烷、环己烷、四氯化碳、苯Brij60[脂肪醇酯]辛烷CTAB[十六烷基三甲基溴化铵]己醇/异辛烷，己醇/辛烷，三氯甲烷/辛烷TritonX己醇/环己烷TOMAC[三辛基甲基氯化氨]环己烷磷脂酰胆碱苯、庚烷表1常用的表面活性剂及其相应的有机溶剂用得最多的是阴离子表面活性剂AOT（丁二酸-2-2乙基己基酯磺酸钠）。图1AOT的结构式将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过CMC时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体，称为正常胶束。若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过CMC，便会在有机溶剂内形成聚集体，称为反胶束。临界胶束浓度(CriticalMicelleConcentration)：胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度。表面活性剂的极性头朝外，疏水的尾部朝内，中间形成非极性的“核”。水非极性的“核”极性“头”非极性“尾”正常胶束图2-a正常胶束的结构示意图表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核”。有机溶剂极性“头”极性的“核”非极性“尾”反胶束图2-b反胶束的结构示意图反胶束的制备相转移法注入法溶解法临界浓度大多数为0.1~1.0mmol/L；含水率WW的值直接影响到反胶束的大小。通常反胶束W40，表面张力0.2mN/m时不稳定，故反胶束最大半径Rm=6nm，适用于相对分子量100000（r=5nm）的蛋白质分子。表水CCW反胶束的特性三、反胶束萃取蛋白质的基本原理图3反胶束萃取蛋白质的示意图蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程，即在宏观两相（有机相和水相）界面间的表面活性剂层同邻近的蛋白质发生静电作用而变形，接着在两相界面形成了包含有蛋白质的反胶束，此反胶束扩散进入有机相中，从而实现了蛋白质的萃取。图4蛋白质在反胶束中的溶解示意图大分子的蛋白质被封闭在“水池”中，表面存在一层水化层与胶束内表面分隔开，从而使蛋白质不与有机溶剂直接接触。依据：1.从准弹性光散射的研究证实在蛋白质分子周围至少存在一个单分子的水层；2.反胶束中酶动力学特性与在水中接近。水壳模型蛋白质溶入反胶束溶液的推动力主要包括表面活性剂与蛋白质的静电作用和位阻效应。反胶束“水池”的物理性能会影响蛋白质的增溶或排斥，达到选择性萃取的效果，具体由Ｗ来调节，这就是所谓的“位阻效应”。四、反胶束萃取蛋白质的影响因素水相pH值离子强度表面活性剂类型、浓度离子种类其他因素当反胶束内表面电荷（表面活性剂极性基团所带的电荷）与蛋白质表面电荷相反时，两者才产生静电作用。对于阳离子表面活性剂，溶液pHpI时，反胶束萃取才可进行；而对于阴离子表面活性剂，pHpI时才可。1、水相pH值图5pH值对蛋白质萃取率的影响对不同相对分子量的蛋白质，pH值对萃取率的影响有差异性，当蛋白质相对分子量增加时，只有增大（pH-pI）的绝对值，相转移才能完成。eg.α－糜蛋白酶（相对分子量为25000）的萃取率在|pH-pI|为2-4时达到最高；而牛血清蛋白（相对分子量为68000）在相同的系统中根本不发生相转移。图6蛋白质相对分子量Mr与最佳pH和pI值之差的关系（在TOMAC-正丁醇体系中萃取）对于包含大蛋白分子的反胶束，其尺寸远大于“空核”的反胶束，萃取时势必要消耗较多的能量，这些能量只能通过较强的静电相互作用得到补偿。用调节pH的作用来增加蛋白质分子表面电荷的方法，正是达到增强静电作用的一条途径。离子强度对萃取率的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用所决定的：1)离子强度增大后，反胶束表面的双电层变薄，减弱了蛋白质与反胶束间的静电作用；2)反胶束内表面的双电层变薄后，也减弱了表面活性剂极性基团间的斥力，使反胶束变小；2、离子强度3)离子强度增大后，增大了离子向反胶束内“水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向；4)盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用，可改变溶解性能。71)从反胶束萃取的机理出发，选用有利于增强蛋白质表面电荷与反胶束内表面电荷间的静电作用和增加反胶束大小的表面活性剂。2)增大表面活性剂的浓度可增加反胶束的数量，从而增大对蛋白质的溶解能力。但浓度过高时，可能在溶液中形成复杂的聚集体，增加反萃取的难度。3、表面活性剂类型及浓度通常反胶束中表面活性剂的极性基团不是完全电离的，有很大一部分阳离子仍在胶团的内表面上，因此阳离子的种类会影响反胶束内表面的电荷密度，该密度越大，产生的反胶束也越大。4、离子种类盐类pH值萃取率（%）核糖核酸酶溶菌酶胰蛋白酶胃乳蛋白酶CaCl21MpH5和pH1015.7100.931.3_CaCl20.1MpH107.698.527.0_CaCl20.1MpH596.0103.059.18.4KCl1MpH54.011.514.4_MgCl20.1MpH586.69.321.4_表2不同离子对蛋白质萃取的影响有机溶剂的种类助表面活性剂温度5、其它因素五、反胶束萃取蛋白质的应用分离蛋白质混合物图8三种蛋白质混合物分离过程示意图从发酵液中提取胞外酶Aries-Barros用AOT/异辛烷体系，从细菌发酵液中提取了2种脂肪酶；Leser从大豆和向日葵中分离了蛋白质、油脂和多酚。直接提取胞内酶Giovenco利用表面活性剂可以破坏细胞壁的特点,用反胶团体系直接提取了胞内酶。蛋白质复性反胶团复性固态变性蛋白质示意图MasafumiSakono等（2004）利用非离子型表面活性剂四甘醇十二烷基醚形成反胶束使碳酸酐酶Ｂ复性，20h内收率达到70%以上。反胶束萃取复性与稀释复性相比较思考:1、什么是正常胶束？什么是反胶束？各在怎样的条件下形成？2、反胶束萃取的基本原理是什么？3、影响反胶束萃取得率的因素有哪些？4、反胶束可用于直接提取胞内酶的原因是什么？