5PCR技术

四、PCR扩增未知DNA片段1、同端化PCR2、反向PCR3、cDNA末端快速扩增技术（RACE）4、mRNA差别显示技术1、同端化PCR基本原理:首先将两条变性的单链DNA的3′端加上同样的特殊引物接头,使其具有相同的末端序列,然后以DNA单链为模板,接头的主体部分为引物,进行PCR扩增得到目的DNA片段。具体方法:将一条具有回文结构的特殊引物接头,加在待扩增的单链DNA片段3′端,然后以其为模板,以该引物接头的5′端主体部分为引物,合成它们的互补链,再通过变性、复性,使新合成的两条链复性。并在DNA聚合酶作用下补平,产生两端都含有所连接引物5′端同一主体序列的模板分子,然后再用该主体序列作引物进行PCR反应,即可使未知序列的基因片段得以扩增。2、反向PCR基本原理:用反向的互补引物来扩增两引物之外的DNA片段。首先用限制性内切酶切割靶DNA片段,并用连接酶,使酶切所得DNA片段自身环化,然后再用内切酶消化核心区,并以该内切酶切点两侧的DNA片段为引物进行PCR扩增,可将邻近已知序列旁侧的未知DNA片段扩增出来。3、cDNA末端快速扩增技术RACE是利用PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA末端的方法,又称为锚定PCR(AnchoredPCR)和单边PCR(One-sidedPCR)。一般有两种RACE策略,分别用于扩增3′或5′端。无论哪一种策略的第一步都需要首先通过反转录把mRNA转化为单链cDNA。在扩增反应中,先根据基因已知部分的序列设计引物;引物(又称锚定引物)带有与cDNA5′或3′端相邻区域互补的序列。这些序列可以是自然存在的,也可以在反转录完成后添加。锚定引物也可以带有接头序列,以方便克隆。在5′RACE中,第一条cDNA单链是以与基因中已知序列互补的寡聚核苷酸片段为引物合成的。去掉RNA模板后,用脱氧核糖核苷末端转移酶或T4RNA连接酶在单链cDNA3′端添加一个锚定引物序列尾巴。然后就可以用与基因中已知序列和锚定序列尾巴互补的序列为引物,进行典型的PCR反应。在3′RACE中,首先用寡聚(dT)引物/接头做引物进行反转录。这一寡聚(dT)引物可与mRNA的多聚(A)尾巴复性。这一寡聚(dT)引物/接头同时还用来在随后的PCR反应中作为锚定引物。反应中的另一引物与基因中某一特定序列互补。4、mRNA差别显示技术基本原理：利用一系列寡核苷酸为引物,其中一种锚定于mRNA3′端poly(A)进行反转录,形成mRNA:cDNA杂交分子。然后进行PCR扩增。扩增时在PCR反应溶液中除加入前一种引物外,再加入另一短的随机引物,通过两组引物的随机组合,使细胞中大约15000种mRNA均有扩增的机会,并在序列胶上显示出清晰的电泳带,从中分离出目的DNA片段。利用真核细胞mRNA均含有ploy(A)末端的特点,把其中3′端引物设计成T11MN(M表示为除T以外的三种碱基,N表示四种碱基中的任意一种),所以共有12种组合,分别对总RNA进行反转录,理论上这12种组合刚好覆盖所有mRNA,而且每一种组合均可有效地进行反转录,反应结束时,应全部形成mRNA:cDNA杂交分子。mRNA反转录出cDNA后,向反应体系中加入另一个十聚核苷酸的随机引物,连同T引物,进行标记的PCR扩增,然后,通过序列胶分析即可将差异表达条带,即目的条带从中检出,然后再回收DNA,并进行常规PCR扩增,即可得到进行进一步鉴定所需要的量。RAPD的缺点：(1)RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；(2)每个标记含有的信息量小；(3)有假阳性或假阴性结果；(4)显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析；(5)用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离。基本原理：对基因组DNA限制性酶切片段进行选择性扩增。首先用限制性酶产生基因组DNA酶切片段，然后使用双链接头与基因组DNA的酶切片段相连接形成扩增反应的模板。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。扩增片段通过变性聚丙烯酰胺电泳分离检测。引物由三部分组成：①核心碱基序列，该序列与人工接头互补；②限制性内切酶识别序列；③引物3’端的选择碱基。选择碱基延伸到酶切片段区，这样只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。AFLP技术包括三个主要内容：①模板的制备；②片段的扩增；③聚丙烯酰胺变性胶电泳分离检测。被扩增的DNA限制性酶切片段由二个限制性内切酶产生，一个为酶切位点较少的限制性酶（如EcoRI），另一个为多酶切位点的限制酶（如MseI）。采用双酶切的原因：①多位点酶切产生小的DNA片段，这些片段易被扩增且片段长短适宜在变性胶上分离；②切点数少的酶可减少扩增片段的数目。由于扩增片段是由多切点酶和切点数较少的酶酶切后产生酶切片段，这样就可选择扩增时所需的选择碱基数目限制在一定的范围内；③利用双酶切使对PCR产物的单链进行标记成为可能，从而防止胶上由于扩增片段双链迁移率不一致而造成的双带现象（doublets）；④双酶切可以对扩增片段的数目进行灵活调节；⑤通过少数引物可产生许多不同的引物组合，从而产生大量的不同的AFLP指纹。AFLP的缺点：（1）此技术受到专利保护，应用受到限制，试剂盒价格昂贵。（2）操作中通常要利用同位素标记，对样品DNA质量要求严格。实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。•一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。•实时荧光定量pcr技术中的一些重要因素：–Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。–Ct值与起始模板的关系，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。可利用来计算出该样品的起始拷贝数。•实时荧光定量PCR中荧光化学：荧光定量pcr所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：•TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。•SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。TaqMan荧光探针SYBR荧光染料•分子信标：分子信标（molecularbeacon）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。•分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。