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5.1DNA的粗提取与鉴定1、提取生物大分子的原理：用一定物理或化学方法分离不同物理或化学性质的生物大分子。生物大分子：指蛋白质、多糖和核酸2、提取DNA的基本思路利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。基础知识（1）DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（2）DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精（一）DNA的溶解性（二）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性（1）酶：蛋白酶能水解蛋白质，对DNA无影响。（2）高温：蛋白质变性(60~80℃);DNA变性(80℃)（3）洗涤剂：瓦解细胞膜，对DNA无影响。（三）DNA分子的鉴定100℃DNA+二苯胺蓝色物一、DNA的理化性质（一）实验材料的选取（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液（三）除去滤液中的杂质(纯化)（四）DNA的析出与鉴定二、实验设计（一）实验材料的选取从下列材料中选取2～3种原则：菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；鱼卵、鸡血、哺乳动物的红细胞、大肠杆菌凡是含有DNA的生物材料都可以考虑选用DNA含量相对较高的组织从核DNA数目来看：鸡78条，哺乳动物血0条，猕猴桃58条，洋葱16条，豌豆14条，菠菜12条，大肠杆菌1条。请选择动植物材料各一种。（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、动物细胞2、植物细胞——容易破碎——需要溶解细胞膜加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌、过滤想一想：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？蒸馏水渗透压低于鸡血细胞，血细胞吸水胀破；另外，搅拌加速细胞膜、核膜破裂，释放出DNA。①加入一定的洗涤剂和食盐②充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液想一想：洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂——溶解细胞膜，利于DNA释放食盐——利于DNA的溶解于研磨液中破碎细胞壁，使细胞核内的DNA释放。研磨不充分，提取的DNA量少，可能看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。2.滤液/研磨液中除DNA外可能含有哪些成分？可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质1.研磨的目的是什么，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？思考方案一原理：方案二原理：方案三原理：（三）去除滤液中的杂质DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同蛋白酶分解蛋白质而不分解DNA蛋白质和DNA的变性温度不同思考：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？高浓度盐溶液溶解DNA，可除去不溶于高盐溶液的杂质；用低盐溶液使DNA析出，可除去溶于低盐溶液中的杂质。（四）DNA的析出与鉴定试剂：95％酒精溶液（等量、冷却）现象：白色丝状物搅拌：沿一个方向1、DNA的析出（纯化）思考：酒精为什么要冷却？①降低核酸水解酶的活性②降低分子运动，易析出沉淀③增加DNA分子柔韧性，减少断裂2、DNA的鉴定100℃DNA+二苯胺蓝色物二苯胺要现配现用思考：回忆一下，鉴定DNA的分布用什么试剂？甲基绿（染成绿色）思考：设置对照的作用？证明二苯胺与NaCl不发生颜色反应。1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。三、操作提示观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重做。四、评价与分析鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图①将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（②也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。③实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）2mol/L鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图⑤过滤→取纱布上的滤物纱布过滤⑥再次溶解DNA2mol/LNaCl溶液⑦加冷酒精使DNA析出（纯化）冷酒精鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图⑧DNA的鉴定DNA的粗提取与鉴定实验原理DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同DNA与其他细胞成分在酒精中溶解度不同DNA和蛋白质的耐受性不同DNA与二苯胺呈现蓝色反应DNA粗提取选择适宜材料破碎细胞DNA的溶解和析出DNA的纯化鉴定DNA与二苯胺混合，沸水浴，呈现蓝色反应总结：答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”6、讨论：①两次蒸馏水第一次：细胞吸水胀破第一步第二次：使DNA黏稠物析出第三步（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？基本步骤：①破碎细胞②溶解核内DNA③析出含DNA的粘稠物④过滤含DNA的粘稠物⑤DNA粘稠物再溶解⑥过滤含DNA的2mol/l的Nacl溶液⑦提取含杂质较少的DNA⑧DNA的鉴定过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关：第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布；第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为1－2层②三次过滤第一次：DNA存在于滤液里第一步第二次：DNA被留在纱布上第四步第三次：DNA存在于滤液里第六步③两次析出第一次：用0.14mol／L的NaCI溶液含杂质多第二次：用冷却的95％的酒精④六次搅拌：朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA第三步第七步1.在用鸡血进行DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是()。A.稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA答：B5.DNA在氯化钠溶液中溶解度有二重性，随着氯化钠溶液浓度的变化而变化。(1)请在下列氯化钠溶液中选出能使DNA析出最彻底的一种_____和溶解度最高的一种_____。A.0.14mol/LB.2mol/LC.0.15mol/LD.0.3mol/LAB