生物化学-12323245183

生物化学第十二章核酸的生物合成掌握DNA的半保留复及DNA复制的起点与方向掌握原核细胞DNA的复制熟悉真核生物DNA复制特点掌握反转录作用及DNA损伤的修复了解细菌的限制修饰系统第十二章核酸的生物合成【目的与要求】1964-1970发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录1953年，Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。中心法则：病毒（复制）复制转录DNARNA蛋白质翻译逆转录RNA的复制存在于RNA病毒DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。第十二章核酸的生物合成1964-1970发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录1953年，Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。中心法则：病毒（复制）复制转录DNARNA蛋白质翻译逆转录RNA的复制存在于RNA病毒第十二章核酸的生物合成Reversetranscription中心法则图示一、DNA的半保留复制2.半保留复制的实验证据:1.定义：1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。第十二章核酸的生物合成DNA复制的可能方式全保留与全新复制分散复制半保留复制DNA半保留复制图示：半保留复制的证明：Meselson和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。第十二章核酸的生物合成复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图DNA的半保留复制的生物学意义：DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。第十二章核酸的生物合成双向复制单向复制二、DNA复制的起点与方向复制中的DNA复制原点复制叉第十二章核酸的生物合成DNA复制的主要方式大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制）真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制）第十二章核酸的生物合成DNA复制的主要方式3不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）单向滚环式复制（噬菌体X174DNA—单链环状）第十二章核酸的生物合成三、原核细胞DNA的复制(DNA指导下的DNA合成)原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。3’-OH.DNA聚合酶：该酶的催化性质如下：第十二章核酸的生物合成原核细胞DNA的复制(DNA指导下的DNA合成)需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3’-OH.合成方向：53DNA聚合酶：该酶的催化性质如下：第十二章核酸的生物合成（1）53聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）；（2）35’外切酶活性（对双链无作用，在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对功能。）；1、DNA聚合酶Ⅰ:1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离。该酶为单体酶,含一个锌原子。为多功能酶，具有:第十二章核酸的生物合成（3）还具有53’外切酶活性（双链有效）；DNA聚合酶Ⅰ:1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离。该酶为单体酶,含一个锌原子。为多功能酶，具有:该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成酶活性，只是对DNA损伤的修复能力下降，容易导致变异和死亡。推测该酶主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其缺口的填补。第十二章核酸的生物合成ArthurKornberg1918StanfordUniversityStanford,CA,USATheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid第十二章核酸的生物合成2、DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ：DNA聚合酶Ⅱ:多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶Ⅰ高；持续合成DNA的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成能力，推测该酶仍然不是真正的DNA聚合酶。该酶具有3’5’外切酶活性。其功能可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。第十二章核酸的生物合成DNA聚合酶Ⅲ:多亚基酶，含十种亚基:（αβγθτδδ’χΨε），其中（αεθ）称为核心酶，β2称为夹子，（γ2δδ’χΨ）组成γ复合物，其主要功能是帮助β亚基夹住DNA，故称为夹子装配器，该酶DNA合成的持续能力强，主要与该结构有关。另外，该酶合成速度大，活性高，缺失时大肠杆菌因DNA复制抑制而致死。因此认为该酶DNA的真正复制酶。第十二章核酸的生物合成DNA聚合酶Ⅲ的异二聚体前导链的合成滞后链的合成DNA聚合酶Ⅲ的β-钳子俯视图DNA双螺旋DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ结构基因＊不同种类的亚基数目相对分子质量3’→5’外切酶5’→3’外切酶聚合速度（核苷酸/分）持续合成能力功能PolA1103,000＋＋1,000-1,2003-200切除引物，修复PolB≥788,000＋－2,4001,500修复PolC≥10830,000＋－15,000-60,000≥500,000复制大肠杆菌三种DNA聚合酶比较第十二章核酸的生物合成3、双链DNA复制的分子机制前导链滞后链冈崎片段前导链：以3’→5’方向的亲代链为模板连续合成的子代链。滞后链：以5’→3’方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。(1)冈崎片段和半不连续复制同位素实验，用含3H的dT标记用T4噬菌体感染的大肠杆菌短时间内分离的DNA均为DNA小片段一段时间后检测到DNA大片段。当用DNA连接酶的缺失的变异株时，检测到大量DNA片段的积累。→证明DNA复制中有小片段合成。1968日本学者冈崎：第十二章核酸的生物合成冈崎片段和半不连续复制测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。似乎两条链都是不连续合成的，后发现是由于U替代dT渗入DNA中，而被尿嘧啶-N-糖基酶切除所致。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，DNA的U不再被切除，则检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。1968日本学者冈崎：第十二章核酸的生物合成(2)冈崎片段的RNA引物DNA复制时不仅需要四种dNTP前体，还需要一个与模板DNA碱基顺序互补的RNA短片（约10bp）段当作引物。RNA引物的合成称引发，由引物体完成。引物体由引物合成酶和另外几种蛋白质共同组成。它可以沿模板链向分叉的方向前进，并断断续续地引发生成后随链的引物RNA短链第十二章核酸的生物合成引物合成酶与引发前体引物合成酶：催化引物RNA的生成引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。第十二章核酸的生物合成引发体可以沿模板链5’3’方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量，n’蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。引物合成酶与引发前体第十二章核酸的生物合成(3)DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口作用特点：大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能连接双链DNA上的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链DNA。DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。第十二章核酸的生物合成(4)母本DNA双链的分离拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。第十二章核酸的生物合成拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。拓扑异构酶Π：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。两类拓扑异构酶作用特点:二者共同控制DNA的拓扑结构。第十二章核酸的生物合成解螺旋酶（解链酶）通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。稳定DNA解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。单链结合蛋白：第十二章核酸的生物合成(5).DNA复制的精确性（高保真复制）DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/109～1/1010，即每109～1010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制1000～10000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：第十二章核酸的生物合成1、碱基的配对规律：模板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/104～1/105。2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低100～1000倍。3、DNA的损伤修复系统。第十二章核酸的生物合成与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)蛋白质功能相对分子量（×103）分子/细胞DNA旋转酶（或拓扑异构酶）DNA解链酶单链结合蛋白引物合成酶DNA聚合酶Ⅰ引入或松开超螺旋使双链DNA解链稳定单链区合成RNA引物除去引物并填满缺口40065746010950300100300第十二章核酸的生物合成参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图小结:DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）复制的终止：复制的起始起始复合物的形成：称为引发RNA引物的合成链的延伸：第十二章核酸的生物合成复制原点oriC和原点的识别：DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用oriC(或o）表示。大肠杆菌的复制原点oriC由245个bp构成，含两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也都是富含A、T的区段。复制原点oriC和原点的识别：从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基因组独立进行复制的单位）。复制原点由DnaA蛋白识别，在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链(DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶Π、SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。复制起始1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、DnaA蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白（HU、ATP参与下,DanA蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4、DnaB借助于水解ATP产生的能量在DnaC的帮助下沿5’→3’方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（DnaG蛋白）开始合成RNA引物。链的延长（冈崎片段的合成）真核生物的冈崎片段为：100-200bp原核生物的冈崎片段为：1000-2000bpDNA链的延伸在DNA