5植物细胞培养与次级代谢产物制备.

第5章植物细胞培养与次级代谢产物制备PreparationofPlantCellMetabolitesChapter5细胞工程plantcellsculture：指在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖获得大量细胞群体的一种技术。植物细胞培养是在植物组织培养的基础上发展起来的，是生产植物次生代谢产物的一种技术。§5.1植物细胞培养及其特点Chapter5细胞工程与微生物细胞相比，植物细胞：•平均直径Largerin30-100times•Tendtooccurinaggregates形成细胞团•Shear-sensitive易被剪切力损伤•Slowgrowing生长慢，周期长•Easilycontaminated易受微生物污染•Light,oxygen,CO2demandCharacteristicsofplantcellscultureChapter5细胞工程Copyright©2011WangWeidong,Allrightsreserved.1、植物细胞培养基无机盐（大量、微量）碳源（蔗糖）有机氮源（水解酪蛋白）有机酸、维生素植物生长激素等§5.2植物细胞培养技术29Chapter5细胞工程2.1Singlecellseparation酶解方法：纤维素酶和果胶酸酶水解掉细胞壁愈伤组织诱导法：(常用)2、植物单细胞分离与小规模培养Chapter5细胞工程由愈伤组织分离单细胞步骤步骤：茎段1）诱导产生愈伤组织；2）愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织松散性；Chapter5细胞工程Copyright©2011WangWeidong,Allrightsreserved.由愈伤组织分离单细胞步骤3）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。悬浮振荡培养4）振动或酶解处理，获得单细胞。Chapter5细胞工程:用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其持续分裂和增殖的培养方法。这个愈伤组织块称为看护愈伤组织。方法：接种于滤纸上培养(1)Nursingculture2.2植物单细胞小规模培养注：离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养下则分裂Nursecallusprovidesnutritionandothersubstancesthatenhancescelldivision.细胞工程（在两层细胞之间放置两层滤纸）(2)饲养层培养饲养层培养：指用X射线等处理过的无活性或分裂很慢的细胞来饲养需要培养的植物细胞。具体方法：①Chapter5Chapter5细胞工程②将饲养细胞与需要培养细胞共混合于培养基中培养③将饲养细胞放于下层，培养细胞置于上层培养④二者细胞共培养于液体培养基中（2）饲养层培养（3）液体浅层静置培养将一定密度的悬浮细胞接种在三角瓶中封口静置培养。Chapter5细胞工程①体积选择法：用大、小孔径筛网过滤、收集单细胞。②冷处理法：4℃低温下处理几天使细胞同步化后，再添加新的培养液培养。③饥饿法：控制营养液浓度，通过饥饿使细胞达到同步化，再添加营养液培养。④抑制法：使用抑制剂如尿苷、5-氟脱氧尿苷、秋水仙素等使细胞达到同步化。（4）细胞同步化培养细胞系(Cellline)：是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。细胞株(Cellstrain)：是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株(Substrain)。2.3细胞系与细胞株细胞株工业化生产需满足条件（1）分散性好，适合大规模悬浮培养。（2）均一性好，细胞大小、生理状态一致。（3）生长速度快，培养周期短，不易染菌。（4）目标产物含量高，容易分离提取。（5）细胞遗传稳定。3.1细胞株筛选1.愈伤组织的诱导与培养：选用植物的目标化合物高产部位作为外植体诱导愈伤组织。愈伤组织形成后，进行继代培养。2.单细胞分离：选取生长快速而疏松的愈伤组织，通过固体培养基继代培养，挑选生长快速的细胞。3.细胞无性系的分离：转移到液体培养基中进行悬浮培养，从中选择分散性好、生长速度快的细胞。4.细胞株筛选：检测目标产物含量，从（3）中选择目标产物含量高的细胞株。5.性能评价：进行较大规模培养，考察细胞生长与目标产物合成的稳定性。6.细胞株获得：得到适合工业化生产的细胞株，保种。（1）一般步骤：（2）细胞株定向富集驯化①激素自养型细胞株的筛选驯化：将愈伤组织或分离到的细胞接种在不含生长素、分裂素的继代培养基中进行传代培养，挑选生长好的细胞进行反复继代培养驯化，可以获得激素自养型细胞。②耐受高剂量有毒物质细胞株的筛选驯化：将愈伤组织或分离到的细胞接种在含高浓度的乙酸盐、苯甲酸钠等可能对细胞产生毒害的化合物的培养基中反复继代培养训化，不断提高这些成分含量，可以获得耐受高剂量有毒物质细胞株。（3）人工诱变筛选细胞株①悬浮培养系统：诱变剂处理后，根据悬浮培养系统中细胞生长较快、细胞群体比较均匀的特点进行筛选。②愈伤组织系统：在前面筛选的基础上，用诱变剂筛选，系统包括：对愈伤组织诱变处理后，再通过选择压进行筛选。③原生质体系统：裸露的原生体容易进行诱变和筛选。①继代培养保存法：将悬浮培养细胞每隔1-2周进行继代培养保存。②低温保存法：5-10℃下培养，但每隔10天左右更换一次培养液。③冰冻保存法：-20℃或液氮下保存。3.2细胞株保存Chapter5细胞工程Copyright©2011WangWeidong,Allrightsreserved.•悬浮培养：将离体的植物细胞接种在液体培养基中，保持良好分散状态下的培养。•特点：1）增加细胞与培养液的接触，促进营养吸收和气体的良好传递；2）细胞生长快，能大量提供比较均匀的细胞；3）容易实现大规模工业化培养。2.4植物细胞大规模悬浮培养Chapter5细胞工程Copyright©2011WangWeidong,Allrightsreserved.StepsofcellsuspensioncultureChapter5细胞工程1延迟期3直线期＊延迟期：适应新培养基环境，很少分裂；＊对数期：细胞开始分裂，数目缓慢增加；＊直线期：细胞分裂旺盛，数目快速增加；＊减缓期：细胞因营养消耗、老化，分裂速度减慢；＊平台期：死亡与生成细胞数目平衡，净增长为零；＊衰亡期：细胞死亡速度加快，细胞自溶、死亡。Growthpatternsinsuspensioncellculture2对数生长期4减缓期6衰亡期5平台期Chapter5细胞工程Copyright©2011WangWeidong,Allrightsreserved.•悬浮培养生物反应器要求：良好的O2传递、液体流动性和低的剪切力。•按搅拌方式分为：机械式和气动式（1）机械搅拌式生物反应器：动力：利用搅拌器使悬液产生径向和轴向流动；挡板:将涡流由径向改为轴向流动，增加O2溶解。优点：搅拌充分，供O2、混合效果好；缺点：剪切力对细胞损伤大。2.4.1植物细胞悬浮培养的生物反应器Chapter5细胞工程气升式反应器优点：剪切力小对细胞损伤少，结构简单，耗能低。缺点：在低气速和后期细胞密度高时，混合效果不良。包括：（2）气升式生物反应器：动力：气量差在底部产生的压力；类型:内环流与外环流。特点：混合较均一（3）鼓泡式生物反应器：动力：底部喷出的气体冲力，液体呈无序湍流；特点:适合剪切力敏感的细胞；缺点：混合效率低。2.4.1植物细胞悬浮培养的生物反应器Chapter5细胞工程AirliftsystemsChapter5细胞工程2.4.2植物细胞培养方式（1）分批培养（Batchculture）特点：一次性添加和收获培养液体，期间不更换。缺点：培养后期营养不足，产率降低；（2）流加式培养：特点：间歇或连续补加一种或多种营养（细胞初始接种的培养液体积一般为终体积的1/2～1/3）；整个培养过程没有培养液流出或细胞产品的收集。Chapter5细胞工程Copyright©2011WangWeidong,Allrightsreserved.（3）半连续式培养半连续式培养（Semi-continuousculture）又称为重复分批式培养或换液培养。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间从中取出部分培养液或者细胞，剩余的细胞作为种子，再用新的培养液补足到原有体积，使生物反应器内的总体积不变。每次稀释培养体积的1/2-3/4，以维持细胞的指数生长状态。Chapter5细胞工程（4）连续培养（Continuousculture）含义：指在培养过程中，以一定速度不断添加营养液，同时以同样速度排出培养物，维持恒定体积的培养。特点：（1）新鲜培养基不断加入，保证了养分的充分供应；（2）可使细胞保持在增殖旺盛的对数生长期中；（3）适于大规模工业化生产加入培养基排出培养基及其培养物Chapter5细胞工程2.5植物细胞固定化培养优点：（1）细胞生长较为缓慢，利于次级代谢产物的积累。（2）利于保持培养液液体性质，利于传质；（3）细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小；（4）利于进行连续培养和生物转化（细胞生长与产物合成分成两个阶段，次级代谢产物合成在生长停止后才大量合成）。细胞固定化培养（Cellimmobilizationculture）是指将游离的细胞包埋在支持物内部或表面、培养液呈流动状态进行培养的一门技术。Chapter5细胞工程•植物细胞固定化需要采用固定剂，是一些多糖和多聚类化合物，常用的包括海藻酸盐、琼脂糖、卡拉胶等。1、海藻酸盐固定化在Ca2+离子等多价阳离子的存在下，海藻酸盐的羧基和Ca2+之间以离子键形成不溶于水的海藻酸钙，从而在细胞表面形成凝胶。如果采用磷酸、柠檬酸、EDTA等螯合剂处理将Ca2+离子除去，又能使胶体溶解释放出细胞。无菌空气入口玻璃瓶细胞和褐藻酸钠混合液空气出口形成胶体颗粒的喷射口隔滤板装有CaCl2溶液的烧瓶2.5.1植物细胞固定化方法海藻酸盐固定化细胞步骤Chapter5细胞工程常用方法：（1）滴入法：将细胞悬浮液与灭菌的含NaCl的卡拉胶溶液混匀，然后滴入含中KCl的培养基中，使其分散成小颗粒。过滤、清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。（2）模铸法：将细胞-卡拉胶溶液注入柱形铸模中形成颗粒。（3）两相法：将细胞-卡拉胶溶液与无菌豆油或石蜡油搅拌混匀，形成液滴置于冰浴中不断搅拌，凝固成均匀颗粒，再离心除去油相和大部分溶液。2、卡拉胶固定化Chapter5细胞工程琼脂糖(Agarose)固定化：（1）凝块法：将细胞悬浮于灭菌的琼脂糖中，搅拌待凝结包埋细胞后，将凝块挤进无菌金属网中，使其分散成小颗粒。清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。（2）模铸法：同卡拉胶法（3）两相法：同卡拉胶法优点：与海藻酸盐、卡拉胶等固定化方法相比，不需要其它离子来保证胶的稳定性。不足：制得的颗粒较大、形状不规则。3、琼脂糖(Agarose)固定化Chapter5细胞工程固定化后需要测定细胞存活率大小，方法有：（1）荧光染色观察法：根据活细胞对FDA（二乙酸荧光素）黄绿色荧光染料能被吸收，而死细胞无法吸收原理鉴定。（2）呼吸强度测定：用氧电极法测定固定化细胞的呼吸强度判断存活率。（3）细胞分解和生长速率的测定：通过测定细胞的湿重或干重增加率反映细胞活性大小。2.5.2固定化细胞活力测定Chapter5细胞工程常用的反应系统有2种：流化床生物反应器(Fluid-bedbioreactor)：通过通入液体或气体使固定化细胞悬浮于反应器中；优点：细胞包埋颗粒小，传质效率高；缺点：剪切力或碰撞会破坏固定化细胞。2.5.3植物细胞固定化生物反应器细胞固定在支持物（如筛网）的内部或表面，细胞固定不动，培养物流体按一定方向（从下向上）从反应器中流过实现混合和传质。优点：单位体积细胞的容量大。缺点：①混合效率低、细胞颗粒大，易造成传质困难；②固定床颗粒或