5生长及控制

第5章：微生物生长与控制1节：微生物生长生长：有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。繁殖：单细胞-由于细胞分裂引起个体数目的增加。多细胞-通过无性或有性孢子使个体数目增加的过程。发育：适合条件下，生长与繁殖始终是交替进行的，从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程称为发育。一、微生物生长测定（一）、纯培养的分离方法稀释平皿分离法划线分离法选择分离法二、计数法二、计数法1、直接计数：(1)计死活总菌数：显微镜下计数酵母等个体较大的微生物使用血球计数器细菌等使用细菌计数玻片(2)死活菌分别计数：酵母：美蓝染色，活细胞无色，死细胞蓝色细菌：丫啶橙染色，活细胞有橙色荧光，死细胞发绿色荧光。(3)比浊法：最常用方法之一，简便。悬液中细胞浓度与浊度成正比，因而可用比色计测量菌的浓度。但被检样品不能有杂质，颜色不能太深。2、间接计数法：是一种活菌计数法(1)平板菌落计数：好氧菌、厌氧菌均可（实验）菌样稀释→与培养基混匀浇注平板→倒置培养→统计菌落形成单位cfu→乘以稀释倍数→菌样含菌数不足：理论上讲，每个菌落是由一个活细胞发育而成，但也常有多个细胞连接在一起而形成一个菌落的。有的细菌发育很慢，或生成的菌落很小而被遗漏。由于操作过程的损伤，会带来较大的误差。Viablecellcount1.dilutesample1ml9ml101001000104105106107cellno/ml2.plateout0.1ml3，细胞物质的测定1）细胞干重：通常细菌干重占湿重的1/5，1mg干菌体含4×109个菌体2）DNA含量:DNA与3,5-二氨基苯甲酸-盐酸具有特殊荧光反应。通过测荧光强度得出DNA含量3）含氮量的测定：凯氏定氮法测总氮量二、细菌纯培养群体生长规律将少量纯培养接种到一恒定体积的新鲜液体培养基中，适宜条件下培养，定时取样测定细菌含量，以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标，得繁殖曲线，对单细胞而言，又称生长曲线。根据生长速率不同，分为几个时期。（一）延迟期lagphase(停滞期、调整期）表现：不立即繁殖，生长速率近于0，菌数几乎不变，细胞形态变大。特点：分裂迟缓，合成代谢活跃，体积增长快，对外界不良环境敏感。原因：调整代谢，合成新的酶系和中间代谢产物以适应新环境。消除：增加接种量；采用最适菌龄接种；培养基成分（种子、发酵）（二）对数期logphase表现：代谢活性最强，几何级数增加，代时最短，生长速率最大。特点：细菌数目增加与原生质总量增加，与菌液浊度增加呈正相关性。世代时间（generationtime）：单个细胞完成一次分裂所需时间，亦即增加一代所需时间。影响G因素：菌种、菌龄、营养成分、营养物浓度（很低时影响）、培养温度。假单胞菌世代时间为9分钟，红色螺旋菌则为5小时，某些嗜冷菌可长达数十天。以大肠杆菌为例，21度时G为62min.;37度时G为17min.（三）稳定期stationaryphase(最高生长期、静止期）表现：新增殖细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，活菌数动态平衡。特点：生长速率又趋于0，细胞总数最高。原因：养分减少；有毒代谢物产生。稳定期细胞内开始积累贮存物，此阶段收获菌体，也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段。延长：补料，调pH、温度等。（四）衰亡期declinephase表现：出现“负生长”，有些细胞开始自溶。菌体产生畸形（有时G+菌会变成G-菌）原因：营养物消耗，有毒物质积累，环境条件改变，而不利于细菌生长，死亡率明显增加对于丝状真菌，细胞数目不呈几何级数增加，无对数生长期，一般有调整期，最高生长期，衰退期。活性污泥生长曲线纵坐标——活性污泥干重，横坐标——培养时间三个阶段（插图）废水处理时，根据水质确定维持那个时期。（插图）三、微生物培养方式（一）分批培养batchculture将微生物置于一定容积培养基内，经培养，最后一次收获。（二）连续培养continuouscultivation不断补充新鲜营养，并及时不断以同样速度排出培养物，则可延长对数期。只要培养液的流动量能使增殖的新菌数相当于流出的老菌数，就可保证总菌量不变，此即连续培养原理。主要参数：D（稀释率）=F（流动速率）/V（容积）连续培养方法1、恒浊连续培养turbidostat不断调节流速使培养液浊度保持恒定。装置适用：收获菌体及与菌体相平行的产物。2、恒化连续培养chemostat恒定流速，及时补充营养，营养物浓度基本恒定，从而保持恒定生长速率。又称恒组成连续培养。培养方式（三）补料分批培养fed-batchculture分批培养中，间歇或连续补加新鲜培养液，但不取出培养物，适当时期将其从反应器中放出。（四）同步培养synchronousculture使所有的细胞都能处于同一生长阶段，同时分裂的培养方式。2节：环境条件对生长影响一、温度低温使体内水分子冻结，停止生化反应某些大分子酶蛋白在低温下变得松散而失活一般来讲，低温降低微生物的代谢活性。低温可以用来保藏食品但不能用来霉菌和消毒高温导致微生物死亡酶遇热失活；非酶蛋白及核酸被破坏；细胞膜中脂类因热溶解使膜出现小孔，细胞内含物泄漏。不同温度范围的微生物种类微生物适应不同生长温度的原理低温微生物：细胞内含有能在低温下进行有效催化的酶；细胞膜含有大量不饱和脂肪酸，在低温下仍具有半流动特点，保持正常的代谢活动。中温微生物：普遍高温微生物：含有抗热性酶，DNA的GC含量高，细胞膜含大量饱和脂肪酸。（三）低温用于食品保藏低温保藏是食品贮藏中，品质下降最低的一种贮藏方法。１、寒冷温度：（14-7℃）嗜冷微生物能生长，但生长比较慢，贮藏有效期比较短，贮藏果蔬食品。２、冷藏温度：（7-0℃）（常用4-8℃）嗜冷微生物能缓慢生长，多数病原菌不能生长，保藏有效期较短，贮藏食品：肉、禽蛋、乳品、果蔬等。３、冻藏温度：低于0℃（常用-18℃）几乎可以阻止所有微生物的生长，可进行长期贮藏，但由于影响食品品质，所以食品工业中一般采取：二、pH主要影响：引起膜电荷变化，从而影响营养吸收影响酶活性改变营养物状态和有害物毒性。有最适pH，此时酶活性最高，其他条件适合，生长速率最高，但不是生产的最适pH。微生物细胞内的pH多接近于中性。活性污泥法pH宜维持在6.5-8.5。6.5以下，活性污泥凝聚性差。微生物生长的pH值范围1、总体说，M生长2＜pH＜9,少数例外.绝大多数在5-92、每种M,有自己的生长pH三基点:最低、最适和最高pH值。大肠杆菌:最低pH4.3,最适pH6.0-8.0,最高pH9.5。3、碱M:喜欢偏碱环境，多数细菌、放线菌细菌：最适pH7.0-7.6放线菌:7.5-8.54、嗜酸M：适合偏酸环境，多数真菌和酵母菌.霉菌：最适pH4.0-5.8酵母菌：3.8-6.05、耐碱M：pH＞9可生活,如脱氮硫杆菌pH11下可生活6、耐酸M：pH＜4可生活，如氧化硫硫杆菌pH1下可生活培养基pH变化的原因及调节原因:1.大多数M使培养基pH下降.如乳酸菌分解G产生乳酸2、有些M使培养基pH上升.如尿素细菌水解尿素产生氨pH调节治标治本过酸时：过碱时：加NaOH、Na2CO3等碱液中和过碱时：加H2SO4、HCl等酸液中和过酸时过碱时加适当氮源：加尿素、NaNO3、NH4OH或蛋白质提高通气量加适当碳源：加糖、乳酸、醋酸、柠檬酸或油脂等降低通气量三、氧化还原电位EhEh与氧分压有关，也与pH有关。不同种类微生物所要求的Eh不同。+0.1vEh影响酶活性，也影响呼吸作用。微生物生长过程Eh变化Eh可以用一些还原剂加以控制。四、溶解氧不同呼吸类型微生物：与分子氧的不同关系。1、好氧微生物aerobic有氧条件下生长，进行有氧呼吸。2、厌氧微生物anaerobic不需分子氧，进行无氧呼吸或发酵。专性厌氧菌—只能在无氧条件下生长，分子氧对其有害。主要梭菌、产甲烷细菌、脱硫弧菌。耐气厌氧菌（aerotolerant)—无论有氧无氧，都进行发酵，分子氧无害。如乳酸菌。3、兼性厌氧微生物facultativeanaerobic有氧与无氧条件下均能生长，但以不同氧化方式获得能量。如酵母菌、一些肠道菌、反硝化细菌。酵母菌酒精发酵时通入氧气，发酵减慢，停止产生乙醇，葡萄糖消耗速率下降，氧对发酵的这种抑制现象称为巴斯德效应。4、微好氧微生物microaerophilic在氧浓度较低条件下生长，进行有氧呼吸。厌氧培养p167氧的危害O2+e→O2—超氧化物自由基，反应力极强，能破坏重要生物分子和膜或形成其他活性氧化物，具有极强的杀菌作用有一些酶可解除危害。这些酶将剧毒的O2—先岐化为H2O2,再还原为H2OSOD过氧化氢酶过氧化物酶好氧菌++—专性厌氧菌———耐气厌氧菌+—+兼性厌氧菌++—微好氧菌++—五、辐射指通过空气或外层空间以波动方式从一个地方传播或传递到另一个地方的能量。（一）紫外线（非电离辐射）200-380nm致死主要是细胞中很多物质对紫外线吸收。DNA和RNA的吸收峰在260nm，蛋白质的吸收峰在280nm。紫外线引起DNA链上的两个相邻胸腺嘧啶形成胸腺嘧啶二聚体（T=T),导致DNA复制。（受损细胞在可见光（510nm)下可恢复活力，称为光复活现象。杀菌作用随剂量增加而增加。紫外线穿透力弱，应用于空气消毒、表面消毒、菌种诱变。（二）电离辐射（X、α、β、γ）效应无专一性，α、β穿透力较弱，X、γ较强。电离辐射使水被电离分解出游离H+,生成O2-,·OH，H2O2等强氧化剂，是蛋白质变性。X、γ射线常被用来诱导微生物突变，选育优良菌种。六、超声波（20，000Hz以上）使细胞破裂，科研中破碎细胞。七、表面张力表面张力是作用在物体表面单位长度上的收缩力。水为7.3×10-4N/m,一般培养基的表面张力为4.5-6.5×10-4N/m.胆汁，Tween80等可降低液体表面张力，限制某些菌的生长，如胆酸盐可抑制肠道内G+菌，但不抑制大肠菌。3节：灭菌与消毒灭菌sterilization：杀死所有微生物。消毒disinfection：杀死一切病原微生物。防腐antisepsis：利用理化因素抑制微生物生长繁殖。化疗chemotherapy：利用具有选择毒性化学药物或抗生素来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗的一种措施。一、常用灭菌消毒方法1、干热灭菌法火焰灭菌（灼烧灭菌）、干热灭菌2、湿热灭菌煮沸消毒、高压蒸汽灭菌、间歇加热灭菌3、过滤除菌4、放射线灭菌二、常用的消毒剂理想的消毒剂：杀菌力强，使用方便；价廉；对人、畜无害；能长期保存；溶解度大；无腐蚀性等。消毒剂种类：氧化剂、重金属盐、有机化合物5节：菌种衰退、复壮和保藏一、衰退与复壮对产量性状而言，菌种的负变就是衰退，其他原有典型性状变得不典型了，也是衰退。一个重要原因是基因突变，与控制生产性状有关的基因负变造成生产性状劣化。培养、保藏条件等也有影响。（一）衰退的防止1、控制传代次数；2、创造适宜的培养条件；3、利用不同类型细胞进行接种传代；4、采用有效的菌种保藏方法，加强菌种管理措施。（二）复壮1、纯种分离2、通过宿主体进行复壮（寄生性微生物）3、淘汰已退化个体二、菌种保藏首先挑选典型优良纯种，其次创造一个有利于休眠的环境条件，还要考虑方法的通用性与简便性。1、低温保藏：冰箱、超低温。2、干燥保藏：土壤、细砂、硅胶等。3、隔绝空气保藏：石蜡油封。4、冻干保藏：综合低温、干燥、真空。5、活体保藏：病原微生物、病毒。菌种保藏机构简介中国微生物菌种保藏管理委员会CCCCM国外美国典型菌种收藏所（ATCC）美国农业部北方地区研究室（NRRL）日本大阪发酵研究所（IFO）