生物化学仪器分析-紫外

下午11时8分1第3章紫外光谱—UltravioletSpectrometry,UV主讲：孙立权2019年8月15日星期四22019年8月15日星期四3§3.1紫外吸收光谱分析基本原理PrinciplesofUV3.1.1紫外吸收光谱的产生3.1.2有机物紫外吸收光谱3.1.3有机物紫外吸收光谱3.1.4蛋白紫外吸收光谱3.1.5核酸紫外吸收光谱3.1.6紫外吸收光谱影响因素3.1.7显色反应2019年8月15日星期四4§3.1紫外吸收光谱分析基本原理PrinciplesofUV3.1.1紫外吸收光谱的产生FormationofUV1.概述基于物质对紫外光选择性吸收的分析方法。250300350400nm1234eλ2019年8月15日星期四52.物质对光的选择性吸收及吸收曲线M+热M+荧光或磷光E=E2-E1=h量子化；选择性吸收定性依据。M+h→M*基态激发态E1（△E）E22019年8月15日星期四6可见—紫外波长范围：100-800nm.(1)远紫外光区:100-200nm(2)近紫外光区:200-400nm(3)可见光区:400-800nm3.1.1紫外吸收光谱的产生FormationofUV2019年8月15日星期四7可见光谱与紫外光谱的共同之处光谱法：可用于结构鉴定、定性和定量分析；定性依据：特征吸收；定量依据：朗伯—比耳定律；能级跃迁：分子中价电子能级跃迁；光谱形状：电子跃迁的同时，伴随着振动、转动能级的跃迁带状光谱。3.1.1紫外吸收光谱的产生FormationofUV2019年8月15日星期四8可见光谱与紫外光谱的共同之处吸收曲线（A-λ曲线）吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。关于吸收曲线的讨论与可见光谱相同3.1.1紫外吸收光谱的产生FormationofUV2019年8月15日星期四93.电子跃迁与分子吸收光谱物质分子内部三种运动形式：（1）电子相对于原子核的运动；（2）原子核在其平衡位置附近的相对振动；（3）分子本身绕其重心的转动。3.1.1紫外吸收光谱的产生FormationofUV2019年8月15日星期四10分子具有三种不同能级：电子能级、振动能级和转动能级三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量。分子的内能：电子能量Ee、振动能量Ev、转动能量Er即Ｅ＝Ｅe+Ｅv+ＥrΔΕeΔΕvΔΕr3.电子跃迁与分子吸收光谱2019年8月15日星期四11能级跃迁电子能级间跃迁的同时，总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。3.电子跃迁与分子吸收光谱2019年8月15日星期四12讨论转动能级间的能量差ΔΕr：0.005～0.050eV，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱；振动能级的能量差ΔΕv约为：0.05～１eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱；电子能级的能量差ΔΕe较大1～20eV。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外—可见光区，紫外—可见光谱或分子的电子光谱。2019年8月15日星期四13讨论吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性的依据。吸收谱带的强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关，也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩尔吸光系数εmax也作为定性的依据。不同物质的λmax有时可能相同，但εmax不一定相同；吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比，定量分析的依据。2019年8月15日星期四141．有机化合物电子类型及电子跃迁类型三种价电子：σ电子、π电子、n/p电子；电子跃迁类型：n→π＊；π→π＊；n→σ＊；σ→σ＊。sp*s*RKE,BnpECOHnpsH3.1.2有机物紫外吸收光谱Ultravioletspectrometryoforganiccompounds2019年8月15日星期四15分子轨道理论：成键轨道—反键轨道。当外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态(反键轨道)跃迁。主要有四种跃迁，所需能量ΔΕ大小顺序为：n→π＊π→π＊n→σ＊σ→σ＊§3.1.2有机物紫外吸收光谱Ultravioletspectrometryoforganiccompounds2019年8月15日星期四162σ→σ＊跃迁所需能量最大；σ电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁；饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区；吸收波长λ200nm；例：甲烷的λmax为125nm,乙烷λmax为135nm。只能被真空紫外分光光度计检测到；作为溶剂使用。2019年8月15日星期四173n→σ＊跃迁所需能量较大。吸收波长为150～250nm，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。末端吸收。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)均呈现n→σ＊跃迁。600215CH3NH2365258CH3I200173CH3CL150184CH3OH1480167H2Oemaxmax（nm）化合物2019年8月15日星期四184π→π＊跃迁所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区，εmax一般在104L·mol－1·cm－1以上，属于强吸收。（1）不饱和烃π→π*跃迁乙烯π→π*跃迁的λmax为165nm,εmax为:1×104L·mol-1·cm-1。K带——共轭非封闭体系的π→π*跃迁C=C发色基团，但p→p*200nm。ccHHHH取代基-SR-NR2-OR-ClCH3红移距离45(nm)40(nm)30(nm)5(nm)5(nm)max=165nm助色基团取代pp*(K带)发生红移165nm217nmppppp₃p₁p₂pp(HOMOLVMO)max（2）共轭烯烃中的p→p*2019年8月15日星期四205n→π＊跃迁含杂原子的双键化合物，或者当有杂原子上的孤对电子与碳原子上的π*轨道，则可产生n→π*跃迁吸收。200400nm。禁阻跃迁，吸收强度很弱，ε102L·mol-1·cm-1。同时存在π→π*跃迁。丙酮π→π*跃迁（K带）：λmax=194nm，εmax=9×103L·mol-1·cm-1；丙酮n→π*跃迁（R带）：λmax=280nm，εmax=22L·mol-1·cm-1(溶剂环己烷)。饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ→σ*，n→σ*跃迁，吸收峰一般出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。不饱合机化合物的电子跃迁类型为n→π*，π→π*跃迁，吸收峰一般大于200nm。2019年8月15日星期四226.生色团与助色团最有用的紫外光谱是由π→π*和n→π*跃迁产生。这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。生色团：是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。能产生紫外--可见吸收、含有π键的不饱和基团称。简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基C=C、羰基C=O、亚硝基N=O、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—C㆔N等。（chromophore）2019年8月15日星期四236.生色团与助色团助色团：一些含有n电子的基团(如--OH、--OR、--NH２、--NHR、--X等)，它们本身没有生色功能(不能吸收λ200nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n—π共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。(auxochrome)2019年8月15日星期四247.红移与蓝移红移:λmax向长波方向移动。蓝移(或紫移):λmax向短波方向移动。增色效应或减色效应:吸收强度即摩尔吸光系数ε增大或减小的现象分别称为~~。有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长λmax和吸收强度发生变化。9.有机化合物的吸收带吸收带(absorptionband):在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。(1)R吸收带(2)K吸收带(3)B吸收带(4)E吸收带2019年8月15日星期四26吸收带及吸收带类型吸收峰对应的波长位置称为吸收带。R吸收带：由于发生n→π＊跃迁而产生的吸收带。n→π＊为禁阻跃迁，跃迁几率很小；一般地，R吸收带的270nm，e100；当使用极性溶剂时，R吸收带发生蓝移。2019年8月15日星期四27吸收带及吸收带类型K吸收带：由π→π*跃迁而产生的吸收带。发生在共轭烯炔分子；吸收很强，ε104；波长位置小于R吸收带。1：乙醚2：水12250300苯酰丙酮非极性→极性n→p*跃迁：兰移；；ep→p*跃迁：红移；；e2019年8月15日星期四28吸收带及吸收带类型B吸收带：位于278nm的吸收带。由苯环的π→π*跃迁引起；吸收较强，ε=1100；在非极性溶剂中测定时有精细结构，而在极性溶剂中精细结构消失。当芳环与发色团直接相连时会同时出现K、B两带(B带波长较长)，且B带产生红移。若分子中含有n电子，还会有R带同时出现。2019年8月15日星期四29吸收带及吸收带类型E吸收带：在一定意义上，苯环可看成三个共轭的乙烯组成。苯环中的这种乙烯键和共轭乙烯键引起的紫外吸收带分别称为E1和E2带。四种吸收带按能量高低排列：一般有E1＞E2≥K＞B＞R2019年8月15日星期四3010.吸收波长的计算非共轭体系：饱和烷烃；有助色团取代的衍生物；孤立发色团。共轭体系：共轭烯烃。165nm217nmppppp₃p₁p₂pp(HOMOLVMO)max基-----是由非环或六环共轭二烯母体决定的基准值；无环、非稠环二烯母体：max=217nm共轭烯烃（不多于四个双键）pp*跃迁吸收峰位置可由伍德沃德——菲泽规则估算。max=基+niia.共轭烯烃中的p→p*异环（稠环）二烯母体：max=217nm同环（非稠环或稠环）二烯母体：max=253nmniI:由双键上取代基种类和个数决定的校正项(1)每增加一个共轭双键+30(2)环外双键+5(3)双键上取代基：酰基（-OCOR）0卤素（-Cl，-Br）+5烷基（-R）+5烷氧基（-OR）+62019年8月15日星期四332172272019年8月15日星期四342019年8月15日星期四35b.羰基化合物共轭烯烃中的p→p*OCRY①Y=H,Rn→s*180-190nmp→p*150-160nmn→p*275-295nm②Y=-NH2,-OH,-OR等助色基团K带红移，R带兰移；R带max=205nm；e10-100KKRRpppnppn165nmpOcppppppncOcc③不饱和醛酮K带红移：165250nmR带红移：290310nm2019年8月15日星期四36c.,-不饱和羧酸及其酯p→p*跃迁K带红移程度小于,-不饱和酮,max约200240nm，e104。由于存在这种共轭，羰基的亲电子性降低，即接受C=C上p电子，形成p→p*跃迁的能力降低，使,-不饱和酸及酯发生p→p*跃迁需要较大的能量，max蓝移。2019年8月15日星期四37d.芳香烃及其杂环化合物苯：E1带180184nm；e=47000E2带200204nme=7000苯环上三个共轭双键的p→p*跃迁特征吸收带；B带230-270nme=200p→p*与苯环振动引起；含取代基时，B带简化，红移。max（nm）emax苯254200甲苯261300间二甲苯2633001，3，5-三甲苯266305六甲苯2723002019年8月15日星期四38乙酰苯紫外光谱图羰基双键与苯环共轭：K带强；苯的E2带与K带合并，红移；取代基使B带简化；氧上的孤对电子：R带，跃迁禁阻，弱；CCH3On→p*;R带p→p*;K带