6微生物的生长.

第六章微生物的生长生长：原生质与细胞组分的增加；繁殖：菌体细胞数量的增加：微生物的生长伴随体积增大和细胞分裂，所以，生长的概念中包含着繁殖。个体生长个体繁殖群体生长个体生长+个体繁殖=群体生长第一节微生物纯培养的生长本节提要：*微生物纯培养的生长*微生物纯培养的接种方法*微生物生长的测定*细菌纯培养群体生长测定*连续培养*同步生长微生物纯培养的生长纯培养（pureculture）：单个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。•对于微生物，由于其主要进行无性生殖，故纯培养即为克隆。•建立纯培养，证实其纯度无可置疑并保持不受污染是微生物学家最重要的任务之一。微生物纯培养的生长一、获得纯培养的方法：•平板分离法•液体分离法•单细胞挑取分离法•选择性培养基分离法微生物纯培养的生长（一）平板分离法：1、划线分离法：快速、方便。分段划线（适用于浓度较大的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）扇形划线方格划线分段划线法微生物纯培养的生长分段划线和连续划线微生物纯培养的生长2、稀释倾注分离法：可定性、定量。方法：先取稀释液注入平皿，再注入45℃左右的培养基，将稀释液冲开培养基表面、中间均会出现菌落。微生物纯培养的生长3、涂布平板法（培养基表面出现菌落）简单易行，但易造成机械损伤微生物纯培养的生长2．液体分离法适用于细胞较大的微生物。用液体培养基对菌液做10倍系列稀释，由此繁殖得到的后代必是纯培养。微生物纯培养的生长3.单细胞（单孢子）分离法在显微镜下用显微操纵器（单细胞挑取器）进行。4.选择性培养基分离（通常做成固体的培养基）微生物纯培养的生长二、纯培养的接种方法根据菌的生长速度的快慢来选择•斜面接种•液体接种微生物纯培养的生长（一）斜面接种：为保存菌种和获得大量菌种(1)密涂布法(适用于各种M，可获得大量菌体)(2)蛇形划线法(适用于易扩散的M)(3)中央划线法(适用于生长快的M)(4)点种法(适用于真菌短时间保存菌种)微生物纯培养的生长（二）穿刺接种法：用于接种试管深层琼脂培养基，以观察细菌运动及鉴定细菌用。若具有运动能力的细菌，它能沿着接种线向外运动而弥散，故形成的穿刺线较粗而散、反之则细而密微生物纯培养的生长（三）液体接种法用接种针在液面边缘1、小接种量：如左；产生混浊2、用无菌滴管或移液管；3、直接倒入；4、利用无菌空气通过特殊搅匀、振荡装置压入；5、利用负压吸入液体基中。三、微生物生长的测定•微生物生长个体数目原生质含量直接测定间接测定微生物生长的测定（一）直接计数法：全菌数法（死菌+活菌）1．计数板计数法说明：血球计数板是一块特制的载玻片，上面有一计数室，面积是1mm2，高0.1mm，容积是0.1mm3（0.1μL）,整个计数室被划分为25中格即400（25×16）个小格，当稀释的菌悬液被加到计数室后，通过计算方格中的菌数可推算出计数室内的总菌数，从而求出每毫升菌液所含的菌数。低倍镜下放大推导公式：•1mL菌液中的总数=•80个小格内酵母菌细胞数80•5个方格中菌总数5×400×10000×稀释倍数×25×10000×稀释倍数•适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为•（1）细菌细胞太小，不易沉降；•（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。•特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。微生物生长的测定2．涂片染色法应用：可同时计数不同微生物的菌数，适于土壤、牛奶中细菌计数。方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代入公式：每ml原菌液含菌数=视野中平均菌数×涂布面积/视野面积×100×稀释倍数微生物生长的测定3.比例计数法•通过细菌与等体积红细胞混合涂片，以细菌数与红细胞数的比例，折算样品中菌的含量。4．电子自动计数器计数法：利用液体与菌体的电导不同特点：快速、简便电子自动计数器法微生物生长的测定5．比浊法：•用光密度（OD）在560nm波长处测溶液混浊度；•特点：快速、简便；但易受干扰。6．膜过滤法：•菌数少于106个/ml时，一定体积样品（牛奶、自来水）通过膜过滤，然后将膜干燥、染色、透明，镜下计数。微生物生长的测定（二）间接计数法：活菌法1．平板计数法：广泛用于各种样品的检测方法：（1）涂布法（菌长在表面）（2）倾注法（菌长在表面和基内）优点：常用、较准确、可对不同种微生物做活菌计数。缺点：时间长、人为误差大，有机械损伤。平板计数法1.dilutesample1ml9ml101001000104105106107牛肉膏培养基土豆培养基高氏培养基将适当稀释的菌液倾注平板或涂布在平板表面，经保温培养后，以平板上出现的菌落数乘以稀释度就可以计算出原菌液的含菌量(cfu/mL)。直径9cm的培养皿平板上出现菌落数一般以50~500为宜。按照国家标准规定的样品菌落总数测定的计数原则，以平板菌落数在30~300之间为报告依据。微生物生长的测定2．液体法：•将待测样品做系列稀释，培养后，根据没生长的最低稀释度和出现生长的最高稀释度，应用“或然率”理论，计算出样品单位体积中细胞的近似值。3．微菌落法：•一定体积的菌液+半固体培养基滴加在无菌玻片上，培养2-4小时，显微镜下计数片上的微菌落数。4.薄膜过滤计数法适用范围：常用该法测定量大、含菌浓度较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。微生物生长的测定（三）测细胞物质的量1．干重法：★方法：洗涤、离心、烘干、称重。特点：用于菌浓度高的样品，直接、可靠、准确。2．含N量测定法：总Pro量=总N量%×6.251.干重法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃或80℃)、称重。一般干重为湿重的10%—20%，而一个细菌细胞一般重约10-12—10-13g。该法适合菌浓较高的样品。微生物生长的测定3.DNA法：•利用DNA可与3，5—二氨基苯甲酸—盐酸溶液（2%）显示特殊荧光反应的原理而设计的。•每个细菌细胞平均含DNA8.4×105mg4.生理指标测定法：即微生物分析法•利用微生物的生长状态，测培养基中某物质的含量，进行定性、定量分析。如测耗氧量、发酵葡萄糖产酸量、维生素或氨基酸消耗量，测算微生物的生长。四、细菌纯培养群体生长测定微生物的生长规律细菌群体形成的过程（图中的数字为小时）酵母群体形成的过程由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。•同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长（synchronousgrowth），进行同步分裂的细胞称为同步细胞。•同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。微生物的个体生长和同步生长Helmstetter-Cummings法原理：某些滤膜可吸附与该滤膜（如硝酸纤维素滤膜）相反电荷细胞的原理。步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。单细胞微生物纯培养群体生长测定分批培养batchculture将微生物置于一定容积的培养基中，在特定的培养条件下，只完成一个生长循环（最后一次收获的培养方法。•如：摇瓶培养•特点：培养基一次加入，不补充不更换。细菌纯培养群体生长测定分批培养：指微生物在一定容积的培养基中，在特定培养条件下只完成一个生长循环（最后一次收获）的培养方法。（封闭系统）连续培养：指微生物在整个生长时间，以一定的方法（恒浊、恒化）使微生物持续的以较恒定的生长速率生长的培养方法。（开放系统）细菌纯培养群体生长测定生长曲线：将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样，测菌量。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。据生长速率常数（每小时分裂次数R）把典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期、衰亡期细菌纯培养群体生长测定（一）据微生物生长速率常数分（1）迟缓期（lagphase）1.现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。2.原因：由于细胞进入新环境,细胞数目无增长，甚至有所下降有一个适应过程，进行大量的酶（诱导酶）的生成。3.细胞特点:细胞的新陈代谢非常旺盛，个体体积显著增大，为细胞分裂作准备。细菌纯培养群体生长测定4.此期长短：与菌种遗传特性、菌龄、接种量、培养条件有关。5.意义：在实际工作中，缩短lagphase的措施：1）加大接种量（群体优势----适应性增强）2）先用对数其的种子（此时细胞分裂旺盛）3）调整培养基的成分，使种子基含有发酵培养基的成分4）选用繁殖快的菌种细菌纯培养群体生长测定（2）对数期(logphase)1.现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。2.细胞特点：此时细胞的大小、组成、生理特征等均趋于一致，代谢活跃，生长速率高，代时稳定。细菌纯培养群体生长测定２．代时（世代时间generationtime,G）：单个细胞完成一次分裂所需要的时间t1—t0G=t/n=3.3(lgx—lgx0)（１）Ｇ与菌种有关；（２）受培养条件(温度、营养成分）的制约；同一菌种在不同培养条件下代时不同３．意义：（１）代谢、生理研究的好材料（２）生产中用其作种营养物浓度与对数期生长速率和产量作用方式：影响微生物的生长速率和总生长量生长限制因子：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制因子8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收获量受影响生长速度和最大收获量受影响时间细胞数或菌体量培养温度对微生物速率的影响温度对微生物生长速率有明显影响，这一规律对发酵实践、食品保藏和夏天防范食物变质和实物中毒有重要参考价值。细菌纯培养群体生长测定(3)稳定期（stationaryphase):1.现象：活菌数目不增不减，生长速率趋于0,曲线有一下降的趋势。2.特点:细胞的菌体形态典型，芽孢形成，细胞内开始贮藏物质。细菌纯培养群体生长测定3.出现原因：1）营养物质大量消耗；2）有毒代谢产物大量积累；3)营养物比例失调4）外界条件影响（pH、高细胞浓度，氧化还原电位等）4.意义：1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：•补充营养物质（补料）•调pH•调整温度2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。细菌纯培养群体生长测定3）产量常数：概念：表示微生物对基质利用效率的高低Y=菌体干重/消耗营养物质的浓度根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量如：Y=0.5，表示要得到5g菌体，需某营养物（葡萄糖）10g。细菌纯培养群体生长测定（4）衰亡期1.现象：细胞死亡速率生长速率。一般总菌数不变,活菌数曲线下降。2.特点：菌体变形，大小不一，细胞出现自溶,生理代谢活动停滞。（二）按照菌体与代谢产物分1.菌体生长期指数期为主2.代谢产物合成期以稳定期为主五、连续培养continuousculture•连续培养在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物，使微生物的增殖速度及培养基中的总菌量保持不变的培养方法。（长期保持在指数期的平衡生长状态和恒定的生长速率）•连续培养用于生产实践就称连续发酵.一个重要特征：是使微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持平衡生长状态和稳定的生长速率。分批培养恒浊法恒化法单批培养连续培养时间连续流入新鲜培养液lg细胞数（个/ml）连续培养连续培养原理恒化器法恒浊器法连续培养的两种类型连续培养（一）