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0天津开发区职业技术学院2007——2008学年度第一学期教案（实践课）工学院生物技术系（部）生物专业06年级课程生物化学实验班级生物061~2姓名张冲1实践课教案首页课题名称生物化学实验课程类型实验课课时（或单元）4课时实验课类型生物化学实践教材（名称、作者、出版社）生物化学实验讲义（自编）教学场所生物实验室接受实践教学单位性质与特色教学目的学习柱色谱的原理和操作方法重点、难点分析实验原理与操作技法实践分组要求3~4人一组，以个人为单位撰写实验报告组长条件与职责管理本组的实验器材和设备，组织组员进行实验实践课所需仪器设备与条件色谱柱（25毫升滴定管），分液漏斗（250毫升），烧杯，滴管，中性氧化铝和碱性氧化铝（100—200目，干燥失重不大于1%）每组各15克，洗脱剂：95%乙醇和蒸馏水，样品：亚甲基蓝，荧光黄，1毫升每组，滤纸，玻璃棉或脱脂棉实践报告（总结）要求实验题目日期实验目的基本原理实验步骤实验结果与分析思考题小结学生对基本理论的理解一般，操作能力有待进一步提高。说明：由于该教案涵盖较广，因此不是各栏必须填写2教案纸3实验一柱色谱法分离物质原理一、目的要求学习柱色谱的原理和操作方法二、基本原理柱色谱法可看作是一种面—液色普法，它是通过色谱柱进行分离的。色谱柱是一根长约20厘米，内径为2厘米，下端具有一个活塞或具有一橡皮管带有弹簧夹的玻璃管，管内装填活化的固体吸附剂（固定相）如氧化铝、硅胶等。在柱子顶部装一分液漏斗，液体样品从柱顶加入，被吸附在柱的上端，然后从分液漏斗加入洗脱溶剂（流动相）如丙酮、石油醚等，由于吸附剂对各组分的吸附能力不同，被吸附较弱的组分随溶剂以较快的速率向下移动，各组分随溶剂以不同的时间从色谱柱下端流出，用容器收集。如各组分为不同颜色的物质，则可以观察到谱带。如为无色物质，则不可直接观察到谱带，有时有的物质在紫外光照射下发出荧光，有时也可以分段收集一定体积的流出液，再用薄层色谱或其他方法检定。三、实验内容柱色谱分离有色物质四、仪器和试剂色谱柱（25毫升滴定管），分液漏斗（250毫升），烧杯，滴管，中性氧化铝和碱性氧化铝（100—200目，干燥失重不大于1%）每组各15克，洗脱剂：95%乙醇和蒸馏水，样品：亚甲基蓝，荧光黄，1毫升每组，滤纸，玻璃棉或脱脂棉开发区职业技术学院教案纸4五、实验步骤1、装柱将已经洗干净并烘干的色谱柱固定在铁架台上，在柱子的底部铺放一点玻璃棉或脱脂棉（不要赛得太紧），然后在柱中装溶剂至一半高，打开柱子下端的活塞，让液体向下流（控制流速每分钟两毫升），将氧化铝分次加入，直到固体离柱的顶部约3—4厘米即可。然后在柱顶加入柱径大小的滤纸或加入5毫升的砂层。不允许柱子的顶部变干（在柱顶必须要保留0.5—1.0厘米高的溶剂以免柱子干裂）。如果不立即使用这个色谱柱，就关好下端的活塞或橡皮弹簧夹。在本实验中在层析柱底端放一点棉花，加入0.5厘米的石英砂，关闭阀门加入10毫升95%乙醇，加入5克氧化铝，开塞保持流速为每秒一滴，使氧化铝均匀下沉（避免出现气泡和裂缝），待氧化铝沉积完成后，再加入1厘米石英砂。2、上样将色谱柱中的溶剂从下端放出，直到液面与石英砂表面一致时，停止放出。用滴管或玻璃棒引流将样品缓慢的注入柱中。注意不要把氧化铝冲浮起来。待样品加完后，放开柱子的活塞使液体流出，直到液面与石英砂表面一致时，停止放出，用0.5毫升乙醇清洗壁上余样；放开柱子的活塞使液体流出，直到液面与石英砂表面一致时，停止放出，再用0.5毫升乙醇清洗壁上余样；放开柱子的活塞使液体流出，直到液面与石英砂表面一致时，停止放出。3、洗脱分离先用95%的乙醇进行洗脱，流速控制在每秒一滴，待接收亚甲基蓝后，将乙醇界面放至石英砂表面，关闭活塞。在用蒸馏水进行洗脱，流速控制在每秒一滴，待接收荧光黄（注意：在更换洗脱液的过程中柱面不能干。）开发区职业技术学院教案纸5六、实验结果测量回收组分的体积，并计算组分的稀释倍数七、思考题1、洗脱液的流速过快或太慢时，对分离效果有什么影响？2、为什么极性大的组分要用极性大的洗脱剂来洗脱？板书设计：生物化学实验一、实验室规则二、试验报告要求三、考核办法四、考勤办法实验一柱色谱法分离物质原理一、目的要求二、基本原理三、实验内容四、仪器和试剂五、实验步骤1、装柱2、上样3、洗脱分离六、实验结果七、思考题开发区职业技术学院实践课教案首页6课题名称氨基酸的纸层析课程类型实验课课时（或单元）4课时实验课类型生物化学实践教材（名称、作者、出版社）生物化学实验讲义（自编）教学场所生物实验室接受实践教学单位性质与特色教学目的学习氨基酸的提取和分离方法重点、难点分析实验原理与操作技法实践分组要求3~4人一组，以个人为单位撰写实验报告组长条件与职责管理本组的实验器材和设备，组织组员进行实验实践课所需仪器设备与条件层析用滤纸——国产新华1号中速滤纸，层析器，毛细管，剪刀，研钵，漏斗，漏斗架，小烧杯，移液管，喷雾器。80%乙醇；氨基酸显色剂（0.1%茚三酮—丙酮溶液）；标准氨基酸混合液（分别将甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸各1毫克溶于5毫升80%乙醇中）；氨基酸纸层析溶剂（正丁醇：乙醇：水=4：1：5）实践报告（总结）要求实验题目日期实验目的基本原理实验步骤实验结果与分析思考题小结学生操作的规范性有待提高说明：由于该教案涵盖较广，因此不是各栏必须填写教案纸7实验二氨基酸的纸层析一、目的要求色谱法是现代一种新的分析分离技术，除纸色谱法外，还发展有气相色谱法，液相色谱法，离子交换色谱法，以及薄层色谱法等，已成为现代生物化学研究中的重要工具。纸色谱法具有操作简便，分离效率高，不需要复杂设备的特点，能对氨基酸、肽、糖类、脂肪酸、维生素等多种物质进行分离鉴定，是生化研究中的重要手段之一。二、基本原理纸色谱法是以滤纸为支持剂的一种层析方法。是根据各种溶质在两种不相混溶的溶剂中的分配系数不同而将不同物质分离开来，它属于分配色谱分离的范畴。由于滤纸是由纤维素组成的，具有亲水性，能吸附一层水膜，这层固定在滤纸上的水膜称为固定相，用做推动（或冲洗）样品的试剂称为流动相。将待分离的样品溶于适当的溶剂，点样于滤纸的一端，在层析时借毛细作用使作为流动相的溶剂，从滤纸一端推向另一端，样品中的各个组分由于分配系数不同，而表现在溶剂中的移动速度（Rf值）不同，从而在滤纸上集中在不同的部位，用测量Rf值的显色定性，洗脱定量，达到分离的目的。Rf值=某物质移动的距离/溶剂移动的距离物质结构，溶剂的酸碱性，滤纸质量，层析温度等均能对Rf值产生影响。本实验进行的是上行纸层析法，除此之外，还有下行纸层析法，双向纸层析法，连续纸层析法等，可参阅有关资料介绍。三、材料与设备层析用滤纸——国产新华1号中速滤纸，层析器，毛细管，剪刀，研钵，漏斗，漏斗架，小烧杯，移液管，喷雾器。开发区职业技术学院教案纸880%乙醇；氨基酸显色剂（0.1%茚三酮—丙酮溶液）；标准氨基酸混合液（分别将甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸各1毫克溶于5毫升80%乙醇中）；氨基酸纸层析溶剂（正丁醇：乙醇：水=4：1：5）四、实验步骤1、取材称取不同的萌发时间的种子（或其他植物材料）2—4克，每组作一种材料，研碎，加入10毫升80%乙醇，在沸水浴中提取5分钟，冷却过滤，收集滤液（可反复过滤三次，收集滤液），将滤液在80℃水浴上浓缩至约为2毫升左右，放入冰箱中备用。2、滤纸准备将层析用滤纸裁成5×15平方厘米的长条（注意：保持滤纸洁净，汗手、唾沫切勿沾上），在距滤纸边2厘米处用铅笔轻划一条线，线上距左右侧1厘米处各点一点，为点样处。3、点样将层析用滤纸用干净纸夹于其中（露出点样处），分别用毛细管吸取提取液和标准氨基酸溶液，分别点样于点样处，注意使毛细管口与滤纸垂直，轻轻碰触点中心，此时，样品就能自动流出，控制样品滴直径在0.5厘米以内（点样量以各种氨基酸含5—20微克为宜）。点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二次。本实验中提取液点样5—10次。标准氨基酸点样2次。4、展层准备洁净、干燥的标本筒（或大口瓶等），将氨基酸层析溶剂15毫升注入底部，盖盖备用。将已点样的滤纸靠近上沿1厘米处打眼穿线后，将此滤纸条悬挂于已准备好的层析器中，饱和一小时后，迅速将层析纸垂直浸入溶剂中，盖紧盖子，放于恒温处进行层析，待流动相的溶剂已达到滤纸上沿1.5厘米处，开盖，小心取出滤纸，用铅笔在溶剂前沿轻划一线，后悬挂于凉处，使溶剂挥发，滤纸干燥，准备显色。开发区职业技术学院教案纸95、显色将0.1%茚三酮—丙酮溶液装在喷雾器中，将滤纸条喷湿后，静置挥发丙酮，待丙酮挥发后放在65℃烘箱（或使用吹风机的暖风）内保温显色，滤纸上有氨基酸的地方显现紫红色。五、实验结果根据显色情况计算Rf值，判断提取液中氨基酸数量，并与标准氨基酸比较。六、思考题试比较不同萌发时期种子氨基酸有何不同？板书设计：实验二氨基酸的纸层析一、目的要求二、基本原理：分配色谱三、材料与设备四、实验步骤1、取材2、滤纸准备3、点样4、展层5、显色五、实验结果六、思考题开发区职业技术学院实践课教案首页10课题名称斐林试剂比色法测定还原糖课程类型实验课课时（或单元）4课时实验课类型生物化学实践教材（名称、作者、出版社）生物化学实验讲义（自编）教学场所生物实验室接受实践教学单位性质与特色教学目的学习721型分光光度计的使用方法学习低速离心机的使用方法掌握实验原理和方法重点、难点分析721型分光光度计的使用方法实践分组要求3~4人一组，以个人为单位撰写实验报告组长条件与职责管理本组的实验器材和设备，组织组员进行实验实践课所需仪器设备与条件1.斐林试剂A液：40gCuSO4.5H2O溶解于蒸馏水定容至1L。2.斐林试剂B液：200g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6.5H2O）与150gNaOH溶于蒸馏水中，并定容至1升。A、B两液分别贮存，使用前等体积混合。3.0.1％葡萄糖标准液：取80℃下烘至恒重的葡萄糖0.1000g，加蒸馏水溶解，定容至100ml。实践报告（总结）要求实验题目日期实验目的基本原理实验步骤实验结果与分析思考题小结实验结果的准确度不够说明：由于该教案涵盖较广，因此不是各栏必须填写教案纸11实验三斐林试剂比色法测定还原糖一、实验原理植物组织中的可溶性糖可分为还原糖（主要是葡萄糖和果糖）和非还原糖（主要是蔗糖）两类。还原糖具有醛基和酮基，在碱性溶液中煮沸，能把斐林试剂中的Cu2+还原成Cu+，使蓝色的斐林试剂脱色，脱色的程度与溶液中含糖量成正比。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：新鲜植物样品或烘干粉碎过的植物样品。（二）仪器设备：1.分光光度计；2.分析天平（感量1／10000）；3.水浴锅；4.具塞刻度试管；5.刻度吸管；6.容量瓶；7.研钵；8.离心机。（三）试剂：1.斐林试剂A液：40gCuSO4.5H2O溶解于蒸馏水定容至1L。2.斐林试剂B液：200g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6.5H2O）与150gNaOH溶于蒸馏水中，并定容至1升。A、B两液分别贮存，使用前等体积混合。3.0.1％葡萄糖标准液：取80℃下烘至恒重的葡萄糖0.1000g，加蒸馏水溶解，定容至100ml。4.0.1NNaOH。5.甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于250ml60％乙醇中。6.10％Pb（Ac）2。7.饱和Na2SO4。开发区职业技术学院教案纸12三、实验步骤1.标准曲线的绘制：各管混合后加塞，于沸水浴中加热15min。取出后自来水冷却，1500rpm离心15min。取上清液，用分光光度计在590nm波长下比色，以蒸馏水作对照，读取吸光度用空白管的吸光度与不同浓度糖的各管的吸光度之差为横坐标，对应的糖含量为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品中还原糖的提取：取新鲜的植物样品洗净、擦干、剪碎，称取10.00g，放入研钵中研磨至糊状，用水洗入250ml容量瓶中。当体积近150ml左右时，加2～3滴甲基红指示剂，如呈红色，可用0.1mol/L的NaOH中和至微黄色。若用风干样品，可称取干粉3.00g，先在烧杯中用少量水湿润，然后