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1实验六、电穿孔方法向活体动物导入外源基因引言：在利用非病毒载体进行外源基因的转移过程中,活体电穿孔法基因导入和表达效率较高,它的特点主要在以下几个方面:首先,在外源基因导入的靶器官的选择方面,理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官,在考虑到靶器官组织生理特性的基础上,如果所选择的局部组织细胞不能把所转移基因的表达产物分泌到外周血液循环中,则在某种意义上说已失去了基因导入的价值,这在基因治疗中是关键性的问题。活体电穿孔法对导入的外源基因片段的大小没有限制,从几kb或十几kb的表达载体,到100～200kb的YAC、BAC基因组,都有成功导入并获得表达的报道[5]。此外活体电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA片段不需要特殊的纯化操作。但电穿孔法也存在难以避免的缺点:首先,外源基因表达持续的时间很短。其次,活体电穿孔法与应用病毒载体法相比外源基因表达效率仍偏低。电穿孔时在能量导入一定的情况下设计施加电压的值。电压过低或过高都会影响外源基因的表达。电压过低时,无法造成细胞膜表面状态的改变,因而外源DNA不能进入细胞内。电压过高时,局部组织积聚过多热量,造成细胞的死亡或组织失去功能,即使外源基因导入细胞,也无法进行正常的表达。哺乳动物常用的活体电压大多为20～100V/cm,最高电压在250～750V/cm。由于电穿孔瞬间在局部会产生大量热,因此操作过程中,DNA转染试剂应保持4℃,同时电穿孔操作部位的温度也应适当降低。此外在电穿孔操作部位温度降低的同时可以有效抑制局部组织的出血和外源DNA的流失,这样也在一定程度上保证了基因的导入效率。1材料与方法1.1材料实验室购买的金鱼、真核表达质粒pCMV/β-gal。实验在北京市北京科技大学理化楼120进行。1.2试剂鱼安定溶液、PBS溶液、固定液、洗液1、洗液2、染液。1.3方法1.3.1电穿孔法转染质粒（第一天）称取50mg鱼安定溶于100ml水中，制成麻醉液。将鱼放入麻醉液中麻醉，待鱼运动缓慢且无规则时取出。用PBS清洗微量注射器针头，再用微量注射器将10μl2质粒溶液打入鱼头部中间隆起的组织中，立即将电击器在注入质粒pCMV/β-gal处贴鱼电击（两电极间应不产生电火花）几次。将电击后的金鱼放回清水中，待鱼清醒后，更换一次清水，培养一天（水中用供氧器提供氧气）。1.3.2转染细胞染色（第二天）将鱼去头处死，取少量电击部位的组织（样品）和其余未注射质粒的组织（空白对照）分别剪碎置于离心管中，小心滴加1ml固定液，室温静置10-15min，然后吸除固定液，加入1ml洗液1，轻轻晃动，室温静置5min，然后吸除洗液1，再加入1ml洗液1，50℃水浴1小时，水浴期间不得离人；吸出洗液1，再加入1ml洗液2，轻轻晃动，室温静置5min，然后吸除洗液2。加入1ml染液，37℃培养箱中静置24h。1.3.2观察（第三天）压片、用光学显微镜观察细胞颜色、拍照。32结果与讨论结果观察到的成功转化的细胞较少，且不易寻找。因为鱼组织较大，做成的切片是很多层细胞叠在一起，很难分辨，只能在边缘寻找。所以在上步操作中应尽量剪碎细胞组织。有一个想法，能不能对金鱼组织参考小鼠肾细胞用胰蛋白酶处理，制成细胞悬液并持续培养至贴壁，易于观察。其次对于转化成功的细胞较少，有可能的原因有：1.在电击是没有控制温度，在室温下，不能有效阻止外源DNA的流失，应置于4℃更有利于提高转化效率。2.电击次数及电极电压未能达到最适，皮下组织未能形成足够的孔道，致使外源DNA流失。3.在第二天取转化组织时可能出现位置上的偏差，可能会取出未转化的组织，因为在活体金鱼身上未能有准确的位置标记。参考文献：陈英，庄延，活体电穿孔法基因导入技术，中国生物工程杂志，2003.5（23）104-1064附录药品的配置表名称配制方法PBS缓冲液NaCl8.00g，Na2HP041.15g，KCl0.20g，KH2P040.20g，pH调至7.2，超纯水定容到1000mL，分装，121℃灭菌20min。0.1M铁氰化钾储液1.646g铁氰化钾加入50mlPBS溶液，121℃灭菌20min。0.1M亚铁氰化钾储液2.112g亚铁氰化加入50mlPBS溶液，121℃灭菌20min。1M七水硫酸镁储液12.323g七水硫酸镁加入50ml去离子水，121℃灭菌20min。固定液（无需灭菌）1×PBS（已灭菌），2％甲醛，0.2％戊二醛，2mMMg2＋（高价阳离子需单独灭菌冷却后，使用前再与PBS溶液混和，以免出现沉淀。下同）洗液1（无需灭菌）1×PBS（已灭菌），2mMMg2＋洗液2（无需灭菌）1×PBS（已灭菌），2mMMg2＋，5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾100mg/mlX-gal储液用N，N-二甲基甲酰胺1ml溶解100mgX-gal，避光保存，无需灭菌染液（现用现制，无需灭菌）在洗液2中加入X-gal储液至终浓度0.2mg/ml