搜索
1第六章生产菌种的培养与保藏第一节种子制备的过程第二节种子质量的控制第三节菌种保藏与复壮2种子扩大培养：是指将保存处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。3从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。4第一节种子制备的过程种子制备一般包括两个过程，即孢子制备过程和生产大量菌丝的种子制备过程。一、孢子制备1.放线菌孢子的制备：使用C、N源不太丰富的琼脂斜面培养基，一般28℃，5-14D菌种入罐方法两种：孢子进罐和摇瓶菌丝进罐52.霉菌孢子的制备：使用天然农产品为培养基，25-28℃，4-14D3.细菌孢子的制备：使用C限量而N丰富的琼脂斜面培养基，一般37℃，1-2D4.对于不产孢子的细菌，一般采用斜面营养细胞保藏法，在斜面培养基或者摇瓶液体培养基上活化，然后作种子罐种子。6二、种子制备种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。母瓶培养摇瓶种子制备子瓶培养种子罐种子制备:一级种子罐、二级种子罐、三级种子罐。7第二节种子质量的控制种子质量的优劣，主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件两个方面。一、影响孢子质量的因素及其控制二、影响种子质量的因素及其控制8第二节种子质量的控制一、影响孢子质量的因素及其控制（一）培养基：蛋白胨、琼脂、水质、氨基酸制备固体培养基时有两条经验：①生产用孢子培养基或作为制备砂土孢子或传代所用的培养基要用比较单一的氮源，以便保持正常菌落类型的优势；②选种或分离用的平板培养基，则需采用较复杂的有机氮源，目的是便于选择特殊代谢的菌落。9一、影响孢子质量的因素及其控制（二）培养温度和湿度要获得高质量的孢子，其最适温度区间很狭窄。菌体的糖代谢和氮代谢的各种酶类，对温度的敏感性是不同的。斜面孢子培养时，培养室的相对湿度对孢子形成的速度、数量和质量有很大影响。10一、影响孢子质量的因素及其控制（三）培养时间和冷藏时间1．孢子的培养时间丝状菌在斜面培养基上的生长发育过程可分为五个阶段：①孢子发芽和基质菌丝生长阶段；②气生菌丝生长阶段；⑧孢子形成阶段；④孢子成熟阶段；⑤斜面衰老菌丝自溶阶段。2．孢子的冷藏时间因菌种不同而异，总的原则是冷藏时间宜短不宜长。11一、影响孢子质量的因素及其控制（四）接种量接种量过大或过小均对孢子质量产生影响，接种量的大小影响到在一定量培养基中孢子的个体数量的多少，进而影响到菌体的生理状况。凡接种后菌落均匀分布整个斜面，隐约可分菌落者为正常接种。接入种子罐的孢子接种量对发酵生产也有影响。12除了以上几个因素需加以控制之外，要获得高质量的孢子，还需要对菌种质量加以控制。用各种方法保存的菌种每过1年都应进行1次自然分离，从中选出形态、生产性能好的单菌落接种孢子培养基。制备好的斜面孢子，要经过摇瓶发酵试验，合格后才能用于发酵生产。13二、影响种子质量的因素及其控制种子质量主要受孢子质量、培养基、培养条件、种龄和接种量等因素的影响。14二、影响种子质量的因素及其控制1.培养基：选择有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，营养成分要适当地丰富和完全，使菌丝粗壮并具有较强的活力。培养基的营养成分要尽可能地和发酵培养基接近，以适合发酵的需要，种子培养基的pH要比较稳定，以适合菌的生长和发育。15二、影响种子质量的因素及其控制2.培养条件种子培养应选择最适温度通气搅拌的控制不同时期的需氧量不同；通气搅拌不足可引起菌丝结团、菌丝粘壁等异常现象；泡沫影响正常的通气搅拌，应控制培养基的消毒质量，甚至考虑改变培养基配方，以减少发泡。16二、影响种子质量的因素及其控制3.种龄种龄：种子培养时间称为种龄。菌体的生理活性因不同的生长阶段而差别很大，接种龄的控制就显得非常重要。最适的种龄一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。17对数生长期的种子能很快适应环境，生长繁殖快，可大大缩短在发酵罐中的调整期，缩短在发酵罐中的非产物合成时间，提高发酵罐的利用率，节省动力消耗。种龄过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、泡沫多、发酵周期延长以及因菌体量过少而菌丝结团，引起异常发酵等等。种龄过老的种子接人发酵罐后，则会因菌体老化而导致生产能力衰退。18影响最适种龄的因素：最适种龄因菌种不同而有很大的差异。（细菌、霉菌、放线菌的种龄区间不同）同一菌种采用不同的工艺条件，其最适的种龄也有所不同。即使在稳定的工艺条件下，同一菌种的不同罐批，最适的种龄也有所不同，应通过多次试验来确定。19二、影响种子质量的因素及其控制4.接种量移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例，称为接种量。发酵罐的接种量的大小与菌种特性、种子质量和发酵条件等有关。20大接种量的优缺点：种子进入发酵罐后容易适应，而且种子液中含有大量的水解酶，有利于对发酵培养基的利用。还可以缩短发酵罐中菌体繁殖至高峰所需的时间，使产物合成速度加快。但是，过大的接种量往往使菌体生长过快、过稠，造成营养基质缺乏或溶解氧不足而不利于发酵；接种量过小，则会引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期延长，菌丝量少，还可能产生菌丝团，导致发酵异常等等。但是，对于某些品种，较小的接种量也可以获得较好的生产效果。21近年来，生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施。为了加大接种量，维持正常生产，常采用双种法、倒种法、混种进罐的方法。22为了加大接种量，有些品种的生产采用双种法，即2个种子罐的种子接人1个发酵罐。有时因为种子罐染菌或种子质量不理想，而采用倒种法，即以适宜的发酵液倒出部分给另一发酵罐作为种子。有时2只种子罐中有1只染菌，此时可采用混种进罐的方法，即以种子液和发酵液混合作为发酵罐的种子。以上三种接种方法运用得当，有可能提高发酵产量，但是其染菌机会和变异机会增多。23二、影响种子质量的因素及其控制5.种子质量标准种子质量标准因产品、菌种及工艺条件不同而有所不同。生产上常用的种子质量标准：(1).细胞或菌体菌体形态、菌体的生长量、种子液外观、有无杂菌。(2).生化指标：糖、氮、磷含量和pH值的变化(3).产物生成量：如多种抗生素发酵(4).酶活力：某种酶的活力，如土霉素24二、影响种子质量的因素及其控制6.种子异常的分析种子异常往往表现为菌种生长发育缓慢或过快、菌丝结团、菌丝粘壁三个方面。（1）菌种生长发育缓慢或过快和孢子质量以及种子罐的培养条件有关。生产中，无菌空气的进罐温度较低或者培养基的灭菌质量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。25（2）菌丝结团菌丝团：在液体培养条件下，繁殖的菌丝并不分散舒展而聚成团状称为菌丝团。菌丝团的影响：菌丝聚集成团会影响菌的呼吸和对营养物质的吸收。产生菌丝团的原因：菌丝结团和搅拌效果差、接种量小有关，一个菌丝团可以由一个孢子生长发育而来，也可由多个菌丝体聚集一起逐渐形成。26（3）菌丝粘壁菌丝粘壁：发酵过程中，菌丝逐步粘附在罐壁上的现象。菌丝粘壁的原因：搅拌效果不好，泡沫过多以及种子罐装料系数过小等。后果：使培养液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。27第三节菌种保藏与复壮一、菌种保藏二、菌种的复壮28一、菌种保藏菌种保藏的主要目的和任务保持菌种的优良生产性能的稳定、不污染杂菌、不死亡。①存活，不丢失，不污染②防止优良性状丧失③随时为生产、科研提供优良菌种29菌种保藏的重要意义：①菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料。②特别是利用微生物进行有关生产，更离不开菌种，如抗生素、氨基酸、酿造等工业。总之，菌种是国家的重要资源，菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。1980年我国成立了中国微生物菌种保藏委员会。30菌种保藏的原理：菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。达到长期保存的目的。一般利用菌种的休眠体（孢子、芽孢等），创造最有利于“休眠”状态的环境条件。好的保藏方法，应能保持菌种优良特性和较高存活率，同时也应考虑到方法本身的经济、简便。31菌种保藏的方法：1.斜面低温保藏法：4℃，1～3个月2.液体石蜡封存保藏法：液体石蜡，4℃，1年3.固体曲保藏法：曲种→干燥剂密封容器、低温或室温，1～3年4.砂土管保藏法：砂土管，干燥低温，1年以上菌丝速冻法5.冷冻干燥法：安瓿管，保护剂，真空水分升华，熔封，低温保存，5～10年6.液氮超低温保藏法：安瓿管，保护剂，液氮罐的气相中，永久性保存32几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价斜面低温低温各大类1~6月简便液石蜡封低温、缺氧各大类1~2年简便固体曲法干燥霉菌放线菌1~3年简便沙土管法干燥无营养产孢子菌1~10年简便有效冷冻干燥干燥无氧低温保护剂各大类5~15年简便有效液氮法无氧超低温有保护剂各大类长期简便有效33菌种保藏的注意事项：1.菌种在保藏前所处的状态一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟的菌种进行保存，效果较好。2.菌种保藏所用的基质碳源、砂土、保护剂3.操作过程对细胞结构的损害冻结速度、加保护剂34二、菌种的复壮菌种衰退：生产上使用的菌种，在使用和保藏过程中，经常会逐渐向不利于生产的方向发生变化，这种变化称之为菌种衰退。衰退的原因：①基因突变，②分离现象。常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱等。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；35防止菌种衰退的方法：①控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）；②选择合适的培养条件；③采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）；④采用有效的菌种保藏方法。36菌种的复壮：使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施。广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。37一般衰退菌种的复壮措施如下：纯种分离：采用自然分离的方法，把衰退菌种的细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来。淘汰衰退的个体：如芽孢产生菌经高温(80℃)处理，可淘汰不产芽孢的个体。选择合适的培养条件：如保藏前所用培养基，有利于菌种原有性状的恢复；加富培养基。38国内外主要菌种保藏机构（1）ATCCAmericanTypeCultureCollection。Rockvil1．Maryland.U.S.A.美国标准菌种收藏所，美国，马里兰州，罗克维尔市.39（2）CSHColdSpringHarborLaboratory.U.S.A.冷泉港研究室，美国.40（3）IAMInstituteofAppliedMicrobiology.UniversityofTokyo，Japan.日本东京大学应用微生物研究所，日本东京.（4）IFOInstituteforFermentation.Osaka，Japan.发酵研究所，日本大阪.（5）KCCKakenChemicalCompanyLtd．Tokyo，Japan.科研化学有限公司，日本东京.41（6）NCTCNationalCollectionofTypeCulture.London，UnitedKingdom.国立标准菌种收藏所，英国伦敦.（7）NIHNationalInstitutesofHealth.Bethesda，Maryland，U.S.A.国立卫生研究所，美国，马里兰州，贝塞斯达.（8）NRRLNorth