生物化学实验基本知识

1第六章生物化学实验基本知识主编：齐锦生编委：孔德娟齐锦生许丽辉杨崇辉周秀霞罗湘衡君智炜张晓玲王芳实验室要求一、实验课的目的1、加深理解：加深对生物化学基本理论的理解。2、掌握技术：掌握生物化学的基本实验方法和实验技术（四大基本技术：离心、电泳、层析、比色）及分子生物学的一些基本技术和方法。3、培养能力：培养学生的思维能力、动手能力和表达能力。4、掌握精髓：科学的精髓是实事求是、敢于探索、善于创新的精神，要对实验中出现的一切反常现象进行讨论，并大胆提出自己的看法。二、生化实验室规则和要求1、预习：课前要预习实验教材，了解实验目的、原理，熟悉操作规程。2、秩序：自觉遵守纪律，维护教学秩序，不准迟到、早退，保持安静，严禁谈笑打闹，听从教师指导，未经教师同意，不得随意离开实验室。3、整洁：搞好实验环境和仪器的卫生整洁，实验台面必须保持整洁，仪器药品要井然有序，公用试剂用毕，应立即盖严放回原处，勿使药品试剂撒在实验台面和地面。实验完毕，需将药品试剂排列整齐，仪器要洗净倒置放好。固体废物，如滤纸、棉花、血块不得倒入水池中，以免堵塞下水道；一般性废液可倒入水池中冲走，但强酸强碱或有毒有害溶液必须用水高度稀释后，方可倒入水池中，同时放水冲走，以免腐蚀水管。全体同学由班长安排轮流值日，负责当天实验室卫生、安全和一些服务性工作，经教师验收合格后，方可离开实验室。4、节约：使用仪器、药品、试剂及各种物品必须厉行节约，并节约水电。应特别注意保持药品和试剂的纯净，严防混杂、乱用和污染。使用和洗涤仪器应小心仔细，防止损坏，贵重仪器使用前应熟悉使用方法，严格遵守操作规程，严禁随意开动，发现故障后应立即报告指导教师，不要自己动手检修，如有损坏按学校规定赔偿。5、安全：注意人身和国家财产安全是至关重要的，要时刻注意防火、防水、防电、防危险品、防事故，以免发生意外。实验室内严禁吸烟。使用乙醚、苯、乙醇、丙酮等易燃品时，不允许在电炉、酒精灯上直接加热。实验中须远离火源，如有危险发生，应首先关掉电源；有机溶剂着火时，勿用水泼，以免扩大燃烧面积，可用沙土、灭火器具灭之。用火时必须严格做到：火着人在，人走火灭。用毕电器后及时切断电源。加热试剂、液体时，管口不要对人，要十分小心操作，避免灼伤人。实验室内一切物品未经本室负责教师批准，严禁携带出室外，有毒物品尤其如此。借物必须办理登记手续。2生物化学实验技术概述一、层析法层析是利用混合物各组分物理化学性质（如：溶解度、吸附能力、电荷和分子量等）的差别，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。层析系统分为两个相：固定相和流动相。由于各组分受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组分得以分离。此法首先用于有色物质的分离，故又称色层析法。层析法是近代生物化学最常用的分析法之一，此法可以分离性质极为相似、而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。层析法有多种类型，根据所用两组分不同分为以下几类：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等；根据操作方式不同分为：柱层析、薄层层析和纸层析等。（一）吸附层析法：吸附层析法（absorptionchromatography）是混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离的方法。吸附层析根据操作方式的不同，分为柱层析与薄层层析两种。1、柱层析法：柱层析法是用一根玻璃管柱，下端铺垫棉花或玻璃棉，管内加吸附剂粉末，用一种溶剂润湿后，即成为吸附柱，如图1中的（1）。然后在柱顶部加入要分离的样品溶液，如图1中的（2）。假如样品内含两种成分A和B，则二者被吸附在柱上端，形成色圈，如图1中的（3）。样品溶液全部溶入吸附柱中之后，接着就加入合适的溶剂洗脱，如图6-0-1中的（4）。A与B就随着溶剂的向下流动而移动。最后分离情况如图1中的（5）所示。图6-0-1二元混合物的柱层析示意图在洗脱过程中，管内连续发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的现象。例如，被吸附后的A粒子被溶解（解吸作用）随溶剂下移，但遇到新的吸附剂，又将A粒子吸附，随后，新溶剂又使A3粒子溶解下移。由于溶剂与吸附剂对A与B的溶解力与吸附力不完全相同，A与B移动的速率也不同，经一定时间，如此反复地溶解与吸附，而形成两个环带，每一环带是一种纯物质。如A与B有颜色可看到色层；如样品无色，可用其它方法使之显色，为进一步鉴定，可将吸附柱从管中顶出来，用刀将各色层切开，然后分别洗脱，现在多采用溶剂洗脱法，即连续加入溶剂，连续分段收集洗脱剂，直到各成分顺序全部从柱中洗出为止。最常用的吸附剂是硅胶和氧化铝。硅胶的吸附能力和含水量关系极大，硅胶吸水后，吸附能力下降，常用于分离非极性的和极性不强的有机物，如甘油脂、磷脂、胆固醇等。2、薄层层析法：薄层层析法是吸附剂在玻璃板上均匀地铺成薄层，把要分析的样品点加到薄层上，然后用适当的溶剂展开，而达到分离、鉴定的目的。其优点是：设备简单，操作容易；层析展开时间短，分离时几乎不受温度的影响；可采用腐蚀性的显色剂，且可以在高温下显色；分离效率高。薄板的制备：所用玻璃板表面必须光滑、清洁。根据制薄板的方法不同薄板可以分为软板和硬板两种。软板即不加粘合剂，将吸附剂干粉直接均匀铺在玻板上；制作简单方便，但是易被吹散。硬板即用粘合剂如水或其他液体，将吸附剂调成糊状再铺板，经干燥后才能使用；制备虽然较繁琐，但易于保存。具体制备方法如下：（1）软板：选用一根直径约为1~1.2cm的玻璃管，根据薄层的厚度在玻璃管两端缠几圈胶布，胶布的厚度按需要的薄层厚度而定。常用的厚度约为0.4~1mm左右。把干的吸附剂倒到玻璃板上，玻板的一端固定，防止推玻璃管时玻板移动，然后将玻璃管压在玻板上，把吸附剂由一端推向另一端，即成薄板。要求：光滑、平整、厚度均匀。（2）硬板：将适当调好的吸附剂倒在两块3mm玻板中间所夹的一块2mm厚度的玻板上，然后用一块边缘光滑的玻片把吸附剂刮向一边，即成厚度一定的薄板。下面介绍氧化铝和硅胶硬板的制备方法。氧化铝硬板：称取氧化铝G25g（G表示石膏，这种氧化铝中含5%锻石膏），加水25ml，在烧杯中调成糊状，铺层，先在空气中干燥，后置于200~220℃烘箱中烤4小时即可使用。硅胶硬板：称取硅胶G30g，加水60~90ml，在烧杯中调成均匀糊状，立即铺层，室温内干燥后置烘箱中烘干。此外，也可用淀粉或羧甲基纤维素钠（CMC）作粘合剂制板。薄层层析的操作步骤是：点样、展开、显色。（二）分配层析：分配层析是利用混合物在二种或二种以上的不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方法。如用带水的材料（载体）作为液相（固定相），加入与水不相混合或仅部分混合的溶剂（流动相），则混合物各组分在两相间发生不同的分配现象而逐渐分开，形成色层。4载体在分配层析中只起负担固定相的作用，它们是一些吸附力小、反应性弱的惰性物质，如淀粉、纤维素粉、滤纸等。固定相除水外，还有稀硫酸、甲醇、仲酰胺等强极性溶液。流动相则采用比固定相极性小或非极性的有机溶剂。纸层析是最广泛应用的一种分配层析。纸层析法以滤纸为载体，滤纸上吸附着水（约含20%—22%）是经常用的固定相，此类有机溶剂如醇、酚等为常用的流动相。把欲分离的物质加在纸的一端，使流动溶剂经此移动，这样就在两相间发生分配现象。由于物质分配系数的不同，就逐渐在纸上集中于不同的部位。在固定相中分配趋势较大的成份，随流动相移动的速度就慢；反之，在流动相分配趋势较小的成分，移动速度就快。物质在纸上移动的速度可以用Rf表示：色斑中心至原点中心的距离Rf=──────────────溶剂前缘至原点中心的距离物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也恒定，因此，可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。纸层析法按操作方法分成两类，即：垂直型和水平型。垂直型是将滤纸条悬起，使流动相向上或向下扩散；水平型是将圆形滤纸置于水平位，溶剂由中心向四周扩散。垂直型使用较广，按分配物质的多寡，将滤纸截成长条，在某一端距边缘2~4cm处点样，待干后，将点样端边缘与溶液接触，在密盖的玻璃缸内进行展开见图6-0-1图6-0-2垂直纸层析上述方法只用一种溶剂系统进行一次展开，称为单向层析。如果样品成分较多，而且彼此的Rf值相近，单向层析分离效果不佳，可用双向层析法，即在长方形或方形滤纸的一角点样，卷成圆筒形，先用第一种溶剂系统展开，展开完毕吹干后转90º，再放于另一种溶剂系统中，向另一方向进行第二次展开，如此各成分分离较为清晰。见图6-0-3图6-0-35（三）离子交换层析：离子交换层析法（ionexchangechromatographyIEC）是利用离子交换剂对需要分离的各种离子有不同的亲和力而达到分离的目的，这种柱层析称为离子交换层析。离子交换剂是通过化学反应将带电荷基团引入惰性支持物上而形成。离子交换作用是指一溶剂中某一种离子与一固体中的另一种具有相同电荷的离子进行相互位置的调换。由于各种离子所带电荷的多少不同，它们对交换剂的亲和力就有所差别。因此，在洗脱过程中，各种离子由固体柱上先、后下来的顺序不同，从而可达到分离的目的。这种离子交换是定量完成的，因此测定溶液中由固体上交换下来的离子量，可知样品中原有离子的含量，也可将吸附在交换剂上的样品的成分用另一洗脱液洗脱下来，进行定量测定。离子交换层析主要用于蛋白质、多肽的分离。核酸也是强极性分子，用离子交换层析也能得到很好的分离效果。离子交换剂种类很多，根据交换剂上吸附的离子交换基团不同，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂；根据惰性支持物不同，又有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶及琼脂糖凝胶等种类。目前大多采用的离子交换剂是合成离子交换剂，即离子交换树脂，其分为两大类：分子中具有酸性基团，能交换阳离子的称为阳离子交换树脂；分子中具有碱性基团，能交换阴离子的称为阴离子交换树脂。按其解离性的大小，又可分为强弱两种：磺酸基（－SO3H）强酸性阳离子交换树脂酚羟基（－OH）弱酸性羧基（－COOH）强碱性季胺基（－NR4）阴离子交换树脂伯胺基（－NH2）弱碱性仲胺基（－NHR）叔胺基（－NR2）交换反应举例如下：R-SO3－H++M+X－R-SO3－M＋+X－H+R4≡N＋OH－+H＋X－R4≡N＋X-+H＋OH-离子交换树脂的交换容量与其结构有关，这直接关系到合成过程。离子交换树脂主要是根据有机化学反应（如硝化、磺化、氯甲基化和胺化等）及高分子合成反应（如聚合及缩合）的基本原理进行合成的。离子交换剂的母体聚合物有苯乙烯、酚醛及丙烯酸等。常见的聚苯乙烯树脂由苯乙烯聚合，再加入二乙稀交联：（方程式1）插入附件16在这个母体上引进功能基就得到各种离子交换树脂，如制备强酸性阳离子树脂时，即将母体加以磺化：（方程式2）插入附件2制备强碱性阴离子交换树脂时，先将母体甲基化后，再加以胺化，即得：（方程式3）插入附件3这里，树脂中二乙烯苯的含量决定了树脂的交联度大小，应尽量选用交联度高些，而且有较高的交换容量的树脂。树脂交换容量的单位为毫克当量/克（干树脂）或者毫克当量/毫升（湿树脂）。测定树脂的交换容量方法：阳离子交换树脂：首先，用氢氧化钠溶液通过已转型为氢型的树脂，将H+替换出来，其反应式：R－SO3H+NaClR－SO3Na+HCl再用酸碱滴定法测定流出液中盐酸的当量数，即可计算交换容量，即：HCl+NaOH→NaCl+H2O而测定阴离子交换树脂交换容量的反应则为：R4NOH+NaClR4NCl+NaOHNaOH+HCl→NaCl+H2O离子交换纤维素是30年来广泛用于分离纯化蛋白质的离子交换剂。目前常用的离子交换纤维素列于下表：7（表1）目前常用的离子交换纤维素离子交换剂游离基团结构阴离子交换剂强碱性TEAEGEQAE-Sephadex弱碱性DEAEPAB中等碱性AEECTEOLADBDBNDPEL三乙基氨基乙基胍基乙基二乙基（2-羟丙基）季胺二乙基氨基乙基对氨基苯甲基氨基乙基三乙醇胺经甘油和多聚甘油链偶联于纤维素的混合基团（混合胺类）苯甲基化的DEAE纤维素苯甲