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一、填空1.等电聚焦的原理是基于蛋白质_等电点_的不同。2.2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。3.NC膜与蛋白结合的机理是：疏水作用；离子作用；结合作用大小与孔径成反比。4.印度墨水的特点是：总蛋白染色；灵敏度高；不能检测亲水蛋白。5.Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，这叫Western印迹。6.抗体与附着于固定基质上的靶蛋白发生特异性反应的印迹叫做免疫印迹，实现了高灵敏和特异性的结合。7.NC膜与蛋白结合的原因包括：疏水作用和离子作用。结合作用大小与孔径成反比。8.免疫性检测一般用抗体做专一探针，过程是：用抗靶蛋白的第一抗体和靶蛋白结合；用标记的第二抗体与第一抗体结合；第二抗体标记物的显色。9.带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。10.阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低。11.电场作用下，毛细管柱中出现电泳现象和电渗流现象。12.电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流。13.淌度不同是电泳分离的基础。14.聚丙烯酰胺凝胶可以防止对流，具有分子筛作用。样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳分离后保持生物活性。15.负染主要用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。16.在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便被分离的蛋白质与SDS充分结合。17.改善焦耳热与温度梯度对分离效率影响的方法是：减小毛细管内径，控制散热。18.毛细管等速电泳一般采用阴极进样，阳极分析。19.蛋白质的非特异性检测：染色法用于凝胶总蛋白检测。20.扩散进样具有双向性，扩散也与电迁移速率和方向无关，可抑制进样偏向，提高定性定量的可靠性。21.IEFE分辨率较不连续PAGE更高，特别适合于分离分子量相同而电荷不同的生物大分子。22.IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。23.在测定未知蛋白时，可先采用pH3-10的载体，经初步测定后改用较窄的以提高分辨率。24.用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分。25.泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。26.蛋白质的非特异性检测：染色法用于凝胶总蛋白的检测。27.常用的检测系统有放射性同位素、酶、荧光素等，通过放射自显影或显色反应检测复抗原——抗体合物，从而达到对蛋白质进行特异性检测和鉴别的目的。28.蛋白质印迹用针对蛋白质特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针。29.蛋白质的净电荷是组成它的氨基酸残基的侧链基团上所有正、负电荷的总和。30.胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的_____染色，其极限灵敏度为_____ng，但这种染液会对蛋白质进行______而影响质谱分析的结果。答：无背景8~10修饰31.负染能专门提高PAGE胶上蛋白质的____，但不能用于膜上染色。结果表现为胶面着色而蛋白质点____。速度快（5~15min），蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。答：回收率透明32.毛细管电泳使用____________，抑制了对流和减小热扩散。它是在内径很小(10～200μm)的______毛细管中进行的，毛细管具有良好的散热效能，沿管壁截面的温度梯度小，因此，允许在毛细管两端加上高至30KV的电压。答：细内径毛细管石英二、问答1.等电聚焦有什么优点？答：分辨率和灵敏度高；电泳区带狭窄；重复性好。2.等电聚焦有什么缺点？答：要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质易发生沉淀；样品中的成分必须停留在其pI，不适用在pI不溶或发生变性的蛋白质。3.进行等电聚焦需要哪些条件？答：有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的pH梯度；有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合；电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带。4.双向电泳中样品制备需要遵循哪些原则？答：应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。5.双向电泳中有哪些增加样品溶解度的手段？答：变性剂；表面活性剂；还原剂；起载体作用的良性电解质。6.蛋白质印迹有哪些应用。答：分析和制备特异成分、检测生命大分子物质之间的相互作用、可作为诊断某些疾病的工具7.与普通电泳相比，毛细管电泳有什么优点？答：使用细内径毛细管，抑制了对流和减小热扩散；分析速度快；分离效率很高；可使用在线检测法；进量少。8.毛细管电泳有什么缺点？答：制备能力差，光学检测器的光路太短，非高灵敏度的检测器难以测出样品峰；凝胶、色谱填充管需专门的灌制设备；大的侧面/截面积比能放大吸附作用，导致蛋白质等的分离效率下降或不出峰，同时也会影响分离的重现性。9.高效毛细管电泳有什么特点？答：仪器简单，易自动化；分析速度快，分离效率高；操作方便，消耗少；应用范围极广。10.HPCE中电渗流的流动为平流还是塞流？答：塞流。11.HPCE中哪些因素影响电渗流？答：电池强度影响；毛细管材料影响；电解质溶液性质影响；温度影响；添加剂影响。12.哪些因素影响区带展宽？答：纵向扩散的影响；进样的影响；焦耳热与温度梯度的影响；溶质与管壁之间的相互作用。13.哪种毛细管电泳进样方式易于实现自动化？答：电动进样方式。14.蛋白质印迹固定化膜应具备的条件？易与靶蛋白结合；不影响蛋白检测；准确反映电泳结果。常用的固定化膜有（举一例）：硝酸纤维素膜、尼龙膜、重氮苄氧甲基纤维素纸15.IPG中pH梯度的选择规则：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。16.为什么要去除样品中的核酸？怎么去除？对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。17.蛋白质印迹蛋白质转移条件的选择离子强度：导电性；低离子强度。pH：合适的pH值使Pr远离其pI而带负电荷。稳定性：好，耐受高电场强度，易于转移。18.蛋白质印迹的优势①一旦转移到固定基质上，Pr比在凝胶中容易接近探针，且几乎所有被转移的Pr都有相同的机会接触探针；②转移到固定基质上的Pr带在探测过程中不会因扩散而失去分辨率；③Pr转移到膜上后能进行多种分析，能得到多份结果；④印迹法只需很少试剂（ng级），处理时间相对短，固定化膜容易操作和保存。⑤蛋白质印迹法是高分辨电泳和灵敏、专一的免疫探测技术的结合！19.双向电泳分析中的样品制备原则：1.应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。2.防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。3.防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。4.完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。5.尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。20.HPCE中电渗流的方向：电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；21.IEFE的检测方法除了各种染色法外还有哪些？答：电泳转移、双相电泳、滴定曲线分析。22.问：列举三种以上的印迹方法。答：点印迹、扩散印迹、溶剂流印迹、电泳印迹。23.影响IPG胶条对蛋白载样量的因素有哪些？①待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。②电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需考虑太多其它因素。③待研究蛋白的丰度：④样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。⑤IPG胶条的pH范围：24.为什么做蛋白质印迹？①PAGE分辨率高，应用广；但进一步分析受限！②PAGE后大部分蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子难以通过凝胶孔到达它的目标；③探测过程中的扩散现象会破坏邻近带的特征。④Western印迹法可以克服上述问题。25.说一种减小毛细管吸附的方法加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。26.核酸对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。27.双向电泳的分类：a.非变性2D-PAGEb.非变性/SDS-2D-PAGEc.非变性/还原/SDS-2D-PAGEd.变性2D-PAGE28.HPEC中影响分离效率的因素：A.纵向扩散的影响B.进样的影响C.焦耳热与温度梯度的影响D.溶质与管壁间的相互作用E.电分散作用与层流现象29.毛细管电泳仪的主要部件：高压电源、毛细管柱、缓冲液池、检测器30.HPEC的类型：毛细管区带电泳、毛细管等电聚焦、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳、胶束电动毛细管电泳31.高效毛细管电泳的应用：离子分析、药物分析、手性化合物分析、氨基酸与蛋白质分析、核酸分析及DNA排序32.请阐述聚丙烯酰胺凝胶作为介质的优点；以及聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点。聚丙烯酰胺凝胶作为介质的优点：①防止对流，把扩散减少到最小；②具有分子筛作用。聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点：（1）可以在天然状态分离生物大分子；（2）可分析蛋白质和别的生物大分子的混合物；（3）电泳分离后仍然保持生物活性。33.阴离子染料有那些缺点？溶液系统中的甲醇会引起NC膜皱缩或破坏；不能用于带正电荷的膜，如尼龙膜，会使膜本身染色;灵敏度较低。34.等电聚焦定义？就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。35.如何选择蛋白质印迹蛋白质的转移条件：离子强度：导电性；低离子强度。pH：合适的pH值使Pr远离其pI而带负电荷。稳定性：好，耐受高电场强度，易于转移。36.为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。37.为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；38.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。三、判断1.双向电泳中第一向等电聚焦时间越长越好。（X）2.判断：中性粒子无法在毛细管电泳当中迁移。答：错误，中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出。3.蛋白质印迹:把电泳或色谱分离的蛋白质转移到固定基质上，再对其进行进一步分析的方法。（对）4.电渗现象:当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动（对）5.理论上讲，聚焦电泳中要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。（√）6.高效毛细管电泳中，毛细管内表面带负电荷，溶液带正电荷，则电渗流流向阳极。（╳）7.样品中若含少量未除净的核酸，则会增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。（T/F）（T）8.双向电泳分为非变性2D-PAGE、非变性/SDS-2D-PAGE、非变性/