生物化学实验技术

生物化学实验技术BiochemicalExperiment1实验目的z掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法；z掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能；z培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。绪论2通过生物化学实验应该做到z学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。z训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。z学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。z掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。3.1实验记录‹实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔)。‹实验中应及时准确地记录(专用纸，事先在记录纸上设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量的数据。‹实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。‹实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。3实验记录与实验报告3实验记录与实验报告3.2实验报告实验报告的格式应为：⑴实验目的；⑵实验原理；⑶仪器、材料和试剂；⑷实验步骤；⑸结果讨论（含数理据处）；⑹注意事项;(7)思考题注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。4实验成绩评分方法„实验预习情况（10%）„实验操作情况（20%）„实验报告情况（30%）„实验考试成绩（40%）实验一离子交换层析法分离氨基酸一、实验目的学习用阳离子交换树脂分离氨基酸的操作方法和基本原理二、原理氨基酸的pI不同，在同一pH下所带电荷的数量和性质不同，与树脂的亲和力就有差异，因此可根据亲和力从小到大的顺序依次被洗脱下来。¾阳离子交换树脂：可供交换的是阳离子；¾阴离子交换树脂：可供交换的是阴离子；z常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯）z阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基z阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基z可交换离子：阳离子：Na+、H+阴离子：Cl-、OH-示意图（交换树脂表面）示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）交换离子不交换离子阳离子交换树脂：可供交换的是阳离子；阴离子交换树脂：可供交换的是阴离子；示意图水分子B物质A物质三、操作步骤1、装柱¾装柱是最关键的一步。¾重力沉降法装柱¾陆续不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面上有胶粒连续均匀地沉降，直至装柱物完全沉降至适当的柱床体积为止。¾柱的表面始终要保持着一层溶剂(一般l～3cm柱高)柱的任何一部分绝对不能“流干”。1、装柱z层析柱的形状，一般直径与高度的比为l：15为宜。z柱形必须根据层析介质和分离目的而定。待分离物质的性质相近，柱越细长，则分离效果越好，但流速较慢。在样品组分并不复杂的情况下，采用“矮胖柱”。2、平衡z层析柱正式使用前，必须平衡至所需的pH和离子强度，一般用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当于4-6倍床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装好的柱必须均匀，无纹路，不含气泡，柱顶交换剂沉积表面十分平坦。z本实验平衡体积：60－80mLz调节流速：0.5mL/min或8-12滴/min3、加样z上样量：0.3-0.5mLz0.5mL缓冲液冲洗加样处2次注意：¾加样的同时开始收集¾加样时且勿搅动树脂床面4、洗脱与收集z尽量维持衡定柱压z每2分钟收集一管，共收集25管5、氨基酸的鉴定每个收集管＋1mL水合茚三酮沸水浴15min比色测定绘制洗脱曲线实验二SDS-PAGE分离蛋白质一、实验目的掌握SDS-PAGE的工作原理和操作方法二、原理不同蛋白质具有不同的分子量，并在一定的pH溶液中带有不同的电荷。但经过SDS处理后的蛋白质，分子表面完全被负电荷所覆盖，因此在电泳时，电泳迁移率近取决于蛋白质的分子量大小而与其所带电荷的性质无关。¾分子筛效应¾浓缩效应三、操作步骤1.安装膜具装封胶条，注意封胶条平面朝下，不能有裂口盖上凹玻璃将凹玻璃冲外装进槽里将楔子插进，将底部插紧2.配制凝胶溶液Š胶的配制(平行电泳两块胶板)胶母液：8.4ml配胶缓冲液：13ml蒸馏水：4ml10%TEMD：0.2ml，混匀10%AP：0.2ml，混匀3.灌胶，加到顶部，来回倾斜去气泡插入梳子胶凝后用夹子将玻璃夹出用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉凝胶旋转180度，凹玻璃向里将玻璃放进槽内加缓冲液4.样品制备：将0.5ml样品液，0.25ml10%SDS和0.25ml1%巯基乙醇于小试管中，置100℃水浴中煮沸3分钟后，取出冷却，然后，加入0.25ml上样缓冲液（0.05%溴酚兰+40%蔗糖溶液），混合。取出混合样品40微升加入样品槽，每个样品重复两个。5.加样6.电泳接通电源，电流恒定为80mA，待溴酚兰指示剂移至离下端0.5cm（约3小时），切断电源，拔去插头，倒出电极缓冲液于大烧杯中（如此缓冲液欲重用时，应把正负电极液分别贮存）。7.剥胶8.染色：考马斯亮蓝染色，详见教材9.脱色10.凝胶（脱色之后）结果分析(1)计算迁移率（Rm值）：计算公式见教材。(2)绘制标准曲线：以标准蛋白亚基的Rm值为横坐标，以相应分子量的对数值为纵坐标，即可绘制出测定蛋白质分子量的标准的线图。(3)计算未知蛋白亚基样品的分子量：根据未知样品样的Rm值，从上述标准曲线图中即可查出其分子量。实验三菜花中核酸的分离与鉴定一、实验目的¾学习和掌握从植物组织中分离核酸的原理和方法¾掌握定糖法测定核酸的原理及操作方法二、原理核酸的提取：三氯乙酸或高氯酸除酸溶小分子有机溶剂去脂类浓盐溶液（10％NaCl）提DNA0.5M高氯酸提RNARNA核糖的测定:苔黑酚法DNA脱氧核糖的测定：二苯胺法三、操作步骤1、核酸的分离菜花花冠20g20mL95％乙醇＋海砂匀浆抽滤滤渣抽滤提取物一搅拌均匀抽滤20mL丙酮滤渣20mL丙酮搅拌5min抽滤滤渣20mL高氯酸冰盐浴搅拌抽滤滤渣20mL95％乙醇滤渣20mL丙酮搅拌5min抽滤至干滤渣40mL10％氯化钠沸水浴15min抽滤滤渣滤液重复一次20mL高氯酸70℃水浴20min抽滤滤液提取物二2、RNA和DNA的定性鉴定（1）二苯胺反应测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧核糖的DNA在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热后，产生蓝色。这是因为DNA嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-6-酮基戊醛，再与二苯胺作用产生蓝色物质。DNA+少量浓硫酸或冰乙酸+蓝色物质注意：DNA、蛋白质和黏多糖等物质对测定有干扰作用。NH按教材表1加入各种试剂，反应后观察并记录结果。表1二苯胺反应加入试剂管号12345蒸馏水/mL1----DNA溶液/mL-1---RNA溶液/mL--1--提取物一/mL---1-提取物二/mL----1二苯胺试剂/mL22222放沸水浴中10min后的现象（2）苔黑酚反应测定核糖的常用方法是苔黑酚法（3，5—二羟基甲苯，即Orcinol反应）。当含有核糖的RNA与浓盐酸及3，5—二羟基甲苯在沸水水浴中加热10～20min后，有绿色物产生，这是因为RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再与3，5—二羟基甲苯作用生成绿色物质。RNA+浓盐酸+绿色化合物注意：DNA、蛋白质和黏多糖等物质对测定有干扰作用。OHCH3OH3100FeClCo按教材表2加入各种试剂，反应后观察并记录结果。表2苔黑酚反应加入试剂管号12345蒸馏水/mL1----DNA溶液/mL-1---RNA溶液/mL--1--提取物一/mL---1-提取物二/mL----1三氯化铁浓盐酸溶液/mL22222苔黑酚乙醇溶液/mL0.20.20.20.20.2放沸水浴中10-20min后的现象由于核酸和脱氧核糖核酸有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比。因此可用定糖法来定性定量测定核酸。上述两种定糖的方法准确性较差，但快速简便，能鉴别DNA和RNA，是鉴定核酸、核苷酸的常用方法。根据现象分析提取物一和提取物二中主要含有什么物质?为什么？思考题：1．核酸分离时为什么要除去小分子物质和脂类物质？本实验是怎样除掉的？2．运用本实验方法是否可以制备得到高纯度核酸?3．快速鉴别RNA和DNA的方法是什么?实验四设计性实验——蛋白质的制备及其含量测定实验类型：给定选题的综合设计性实验实验目的：通过学习的生物化学知识和实验技术，学会自行设计一种含蛋白质的样品处理方法、蛋白质制备方法和测定方法。基本要求：掌握常用的蛋白质制备和定量测定的方法及其原理，能够根据样品的种类不同设计蛋白质制备的方法，并根据蛋白质性质不同设计选用相应的定量测定方法。培养目标：通过实验方案设计及方法选择，使学生了解不同来源蛋白质制备的基本原理与方法；熟悉几种蛋白质含量测定方法的基本原理及应用条件；学会设计并实施一种蛋白质的制备及测定实验方案；通过实验独立完成试剂的配制、蛋白质的制备、标准曲线的制作、蛋白质含量测定、结果计算、方案实施总结全过程。并能够熟练使用离心机、分光光度计等进行蛋白质制备和紫外、可见分光光度测定。可选择的蛋白质含量测定方法有：（一）紫外分光光度法（二）Bradford法（三）微量凯氏定氮法（四）双缩脲法等（五）Folin-酚法实验报告：要求给出实验目的、设计方案及设计原理、实验技术路线和参数选择的依据、实验参考文献、实验方法和步骤、实验结果和分析、总结。第一部分：蛋白质样品的选择、处理及制备设计要求：（1）蛋白质样品的选择:乳制品、植物蛋白、动物蛋白等（2）处理方法的选择：根据所要制备和测定的蛋白质样品的来源、种类和特性选择处理的方法——可选择粉碎、匀浆、超声破壁等方法（3）制备方法的选择：根据要测定的蛋白质组分选择制备的方法——要求必需选择一种蛋白质样品的制备方法，如采用特定溶剂提取后测定特定溶解性的蛋白质、分离纯化后测定特定组分的蛋白质或除去脂肪等杂质制备粗蛋白测定蛋白质等等。根据以上选择制定实验方案，并确定具体的实验参数，具体实验步骤和参数的选择可参考实验教材。第二部分：样品中蛋白质含量的测定设计要求：（1）根据所制备的样品中蛋白质的性质选择合适的测定方法，如粗制品的粗蛋白质含量和蛋白质含量一般可选择凯氏定氮法，纯化后没有干扰的蛋白质样品可选择紫外分光光度法等其它方法，标准蛋白质为牛血清白蛋白。（2）参考附录中提供的可选用的方法，制定测定的具体实验方案。思考题：1．比较几种方法的优点和缺点？2．为什么标准蛋白质必须用凯氏定氮法测定度？3．若样品中含有核酸杂质，紫外法测定时应如何排除干扰？4.说明你所选择的蛋白质样品、制备方法和蛋白质含量测定方法的依据。