生物化学实验指导课件

生物化学实验指导课件天水师范学院生物系二OO二年二月天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南前言随着生物化学的发展和生物化学教学内容的不断丰富。生物化学实验也在不断更新和提高。1992年，我们编写了一本《生物化学实验指导》作为专科生实验教材，并在实验教学的过程中不断修改并加以充实。这次编写的生物化学实验指导是在以往工作的基础上，结合生物化学实验教学改革、作为本、专科生物化学实验教改项目的一个重要内容。在这次编写过程中，我们确立了这样一个指导思想⑴去掉了许多定性和验证性实验，加大了定量分析的内容；⑵在同一项目实验中，同时介绍了不止一种方法和技术⑶增加了部分大实验，力求使学生有一个完整的实验训练过程，有利于培养学生实验设计能力、分析问题能力和独立操作能力，以达到知识、能力和素质的全面提高。本实验指导共计十五个实验，分基础实验、提高实验、高级实验三篇，内容覆盖了当今生物化学研究中常用的方法与技术。生物化学实验指导天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南实验一蛋白质的沉淀、变性反应实验二蛋白质的等电点测定(pH法)实验三酶的特性实验四菜花(花椰菜)中核酸的分离和鉴定基础实验天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南实验一3，5—二硝基水杨酸比色定糖法实验二Fo1in—酚法测定血清蛋白质含量实验三血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验四蛋白质分子量测定（葡聚糖凝胶薄层层析法）实验五脂肪酸的β-氧化实验六核酸浓度测定—定磷法实验七血液中转氨酶活力的测定(分光光度法)实验八维生素C的定量测定提高实验天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南实验一酯酶的分离、纯化与活性测定实验二酯酶同功酶的垂直板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分析实验三底物浓度对酶促反应速度的影响（米氏常数的测定）高级实验天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南注意事项返回实验器材、药品实验原理实验操作酯酶的分离、纯化与活性测定天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南酯酶是A—酯酶，B—酯酶和胆碱酯酶的总称，它与人体有机磷药物中毒机制有关。本实验利用离子交换层析法分离和纯化酯酶，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(CM—纤维素)，阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素(DEAE—纤维素).蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力，这又与溶液的pH有关，因为pH决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质的相反电荷基团之间的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变pH或离子强度(或二者同时改变)来实现；与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。本实验采用CM—纤维素离子交换剂，通过柱层析，经梯度洗脱从鼠肾丙酮粉抽提液中分离、纯化酯酶。梯度洗脱法是在洗脱过程中，使洗脱液的pH或盐浓度(或两者同时)发生连续的梯度变化，从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下洗脱下来。本实验采用的是盐离子浓度梯度洗脱法，其装置由两个彼此相连的容器组成，在与层析柱相连接的一个容器(混合瓶)中，放入梯度洗脱开始时所需浓度的盐溶液(低浓度)，并配有搅拌装置，另一容器(贮液瓶)中放入高浓度的盐溶液，其浓度即梯度洗脱最后所需的浓度。两个容器的底部必须保持水平，液面的高度也应该相同。这样，当两容器之间的通道打开，并使混合瓶溶液流进层析柱时，梯度即开始形成。由于这两个容器是连通的，当混合瓶的溶液开始流入层析柱，它的液面高度就逐渐下降，为了维持两容器的液面高度的一致，高浓度的盐溶液即从导管流入混合瓶，结果混合瓶中溶液的盐浓度呈梯度上升。原理返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南操作一粗酶制剂的制备二CM—纤维素离子交换剂的处理三层析柱的安装和平衡四加样和梯度洗脱五酯酶活性的测定六结果处理返回流程图结果处理酯酶活性测定梯度洗脱上样组合层析装置层析柱安装层析介质处理粗酶制剂制备天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南一、粗酶制剂的制备杀死大白鼠，迅速剖腹取肾，置于冰浴中剔除脂肪和结缔组织。新鲜肾组织和—15℃丙酮，按10g重量和100m1容积的比例，一同置入Waring捣碎器中捣碎，为避免温度升高，捣碎0.5min后，把匀浆倒入烧杯中，置于冰盐浴冷至—15℃，再捣碎0.5min，反复3次。然后把匀浆倾人布氏漏斗抽滤，用—15℃丙酮洗涤3次，按上述方法再捣碎滤饼，抽滤和洗涤一次。将最后得到的滤饼散置于表面皿，放入真空干燥器干燥数天，即得丙酮粉干品，每10g新鲜肾组织可制得丙酮粉3—4g。按100mg丙酮粉加入5m11×10—2mo1／lpH6.0磷酸缓冲液的比例，将二者放入烧杯中，置于冰箱内抽提30min，不时搅拌。抽提液在3000r／min下离心10min，上清液即为粗酶制剂(保存于冰箱待用)。测定此粗酶制剂的蛋白含量(按Fo1in—酚试剂法)和酶活性。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南二、CM—纤维素离子交换剂的处理称10gCM—纤维素干品置于烧杯中，加入100ml0.5mol／lNaOH—0.5mol从NaCl溶液，混匀，静置15min后，在布氏漏斗中抽滤，水洗滤饼至中性。此滤饼再悬浮于100m11mo1／lHCl溶液中，混匀，静置10min后放入布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。再将滤饼悬浮于100m10.5mo1／lNaOH—0.5mo1／lNaCl溶液中，混匀，静置15min后放入布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。最后将滤饼悬浮于所选择的起始洗脱缓冲液中。使用后的回收处理和上述步骤相同，只是省略了将滤饼悬浮于1mo1／lHCl溶液这一步。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南三、层析柱的安装和平衡洗净一支1.5×40cm的玻璃(管)柱(也可选用规格合适的商品层析柱)，准备两个橡皮塞，将其中一个的中央插入一根玻璃细管，上面覆盖一圆形尼龙网片或一块绢布。玻璃细管上连接一根细胶管，与部分收集器相连，将这个橡皮塞安入层析柱的下端，另一橡皮塞中央也插人一根玻璃细管，并接上一根胶管与洗脱液混合瓶下口相连。此橡皮塞塞入层析柱的上端。两端胶管上各备一个螺旋夹。将层析柱架至垂直，夹紧下端胶管，向层析柱内加入蒸馏水(约2／3柱高)，然后将预处理好的离子交换纤维素装入柱内，使其自由沉降至柱的底部，放松柱下端螺旋夹，让柱内液体慢慢流出。待树脂沉降至所需高度(约30cm)后，置一圆形滤纸或尼龙片于胶面，待胶面只剩下一薄层水时，夹紧下端夹子，向柱内加入数ml洗脱起始缓冲液，松开下端夹子，用起始缓冲液渗洗平衡，先是压力较小，后增至洗脱时的压力(平衡10h左右为宜)。若平衡压力过大，柱内树脂被压迫太紧，影响流速。平衡好的柱面应存留一薄层缓冲液，旋紧下端螺旋夹。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南四、加样和梯度洗脱用滴管将4m1粗酶制剂溶液(总蛋白含量15mg)沿柱内壁徐徐地加到纤维素柱面，然后慢慢放松下端螺旋夹，使样品液面降至纤维素柱表面，再加入少许洗脱起始缓冲液洗涤柱壁，如上操作，反复进行2次。梯度洗脱采用图39.1的装置实现。A为贮液瓶，B为混合瓶，二者容量相等，且置于同一水平面。C为A，B二瓶连通管的活塞，D为搅拌器，E为混合瓶的通嘴活塞。A盛高浓度洗脱缓冲液，B盛等体积起始洗脱缓冲液。洗脱前先开动搅拌器，后启开活塞C和E，B瓶洗脱液浓度呈直线式递增。关紧活塞C和E，在A瓶中加入1×10—lmo1／lpH6.0磷酸缓冲液150m1，在B瓶中加入5×10—3mol/lpH6.0磷酸缓冲液150m1，将混合瓶B上的胶管与层析柱连接上之后，开动搅拌器，打开A，B两瓶之间连通管的活塞C，再打开B瓶的通嘴活塞E，控制流速在2ml／20min。开动部分收集器，分管收集流出液，每管收集2ml。实验在0—10℃的温度范围内进行。测定各管流出液的酶活性，同时用Fo1in—酚试剂法测定，每管流出液的蛋白含量。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南五、酯酶活性的测定底物乙酰—2，6—二氯酚靛酚被酯酶水解后生成的2，6—二氯酚靛酚在pH8.0的条件下显蓝色，底物浓度恒定时，酶促反应速度取决于酶的活性。测定时，取4m15×10—2mo1／lpH8.0的磷酸缓冲液，加0.2m1底物(最终浓变为1.25×10—4mo1／l)，再加适量酶溶液(0.5m1含200μg蛋白质)和水，使反应系统的最终容积为6m1，在30℃下反应5min后立即在600nm波长处测定A值。本实验是各管取0.5m1梯度洗脱液测定酶活性。若光吸收值越大，表示酶活性越高。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南六、结果处理1.以梯度洗脱流出液的管数为横坐标，以相应流出液的蛋白含量为纵坐标，作出洗脱洗脱曲线图，峰Ⅰ′和Ⅱ′为两个主要酶蛋白峰。蛋白含量以1m1梯度洗脱液(Fo1in—酚试剂法测定)在500nm波长处比色的光吸收值表示。2.以梯度洗脱流出液的管数为横坐标，以相应流出液酶活性(取0.5m1测定，在600nm波长处的A值)为纵坐标，绘制出酶活性曲线图，得到两个主要酶活性峰I和Ⅱ(见图)。3.以梯度洗脱流出液的管数为横坐标，梯度洗脱液浓度为纵坐标，绘制出梯度洗脱液浓度曲线图。4.分别合并峰I和Ⅱ两个组分，测定它们的蛋白含量和酶活性，并计算比活性。比活性的计算方法如下：酯酶比活性=酶作用底物后在600nm波长处的A值/mg蛋白量最后列出鼠肾粗酶制剂(丙酮粉原抽提液)和层析洗脱液酯酶比活性的比较以及蛋白回收率（见表）。由表列的数据看出，酯酶集中在峰Ⅱ。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南蛋白含量、酶活性和梯度洗脱液浓度曲线—▲—代表蛋白含量曲线，—●—●—表示酶活性曲线，——表示洗脱液浓度曲线。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南粗酶制剂和层析洗脱液酯酶比活性的比较蛋白量(mg)蛋白回收率比活性提高倍数粗酶制剂(丙酮粉抽提液)4m1峰Ⅰ0.210.3峰Ⅱ7.410比活性A(mg蛋白)CM—纤维素离子交换剂层析后梯度洗脱液10.570%115100%0.73返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南试剂与器材一、试剂[1]丙酮[2]1×10—2mo1／lpH6.0磷酸缓冲液[3]5×10—2mo1／lpH8.0磷酸缓冲液[4]3.75×10—3mo1／l乙酰—2，6-二氯酚靛酚丙酮溶液[5]0.5mo1／lNaOH—0.5mo1／lNaCl溶液[6]1mo1／lHCl溶液[7]5×10—3mo1／lpH6.0磷酸缓冲液[8]0.1mo1／lpH6.0磷酸缓冲液[9]CM—纤维素(0.069mmo1／g干粉，PK＝3.5)。二、器材[1]waring捣碎器[2]布氏漏斗[3]抽滤瓶[4]表面皿[5]离心机[6]国产724型分光光度计[7]梯度混合器[8]1.5×40cm玻璃柱[9]试管[10]自动收集器[11]移液管[12]量简[13]烧杯[14]玻璃漏斗。返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南返回天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南注意事项返回实验器材、药品实验原理实验操作酯酶同功酶的垂直板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分析天水师范学院生物系主页提高实验基础实验高级实验成员本站指南聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryamidegelelectrophoresis简称PAGE）根据其有无浓缩效应，分为连续与