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生物化学实验教案2008—2009学年度第一学期开课单位水产学院课程名称生物化学实验授课班级养殖0713任课教师韩芳试验一蛋白质显色反应和氨基酸纸层析（一）蛋白质的显色反应一、目的要求：1、理解蛋白质具有双缩脲反应。2、理解蛋白质和α--氨基酸均能与茚三酮作用产生有色化合物。3、了解氨基酸、蛋白质的某些侧链功能基团能发生黄色反应、米伦氏反应等显色反应。二、教学方法和教学学时：1、教学方法：学生操作实验，教师指导。2、教学学时：2学时。三、实验内容：蛋白质是由很多氨基酸通过特殊的结构而形成的，氨基酸以及这些特殊的结构与化学试剂作用而产生颜色，称呈色反应。蛋白质的呈色反应非常灵敏，常用作检验蛋白质和某些氨基酸的反应，也是定量测定的依据。一、双缩脲反应：验证蛋白质具有双缩脲反应，能观察到蓝紫色的出现。l．取小量固体尿素，故在干燥小试管中，在弱火上加热，此时尿素溶融并放出氮，直到溶融物呈白色而坚硬的停止加热。2．冷却后，加入10％NaOH溶液1ml，摇匀溶解，再加入1％CuSO4溶液5滴，摇匀，观察颜色。3．取另一小试管，加入10％NaOH溶液1ml及1％CuSO4溶液5滴，后逐滴加入1％卵清蛋白溶液，观察溶液颜色的变化。二、茚三酮反应：验证蛋白质能与茚三酮作用产生蓝紫色化合物。l．取干净滤纸一小片，滴上1％酪氨酸溶液1滴，酒精灯上小火烘干。2．冷却后加l～2滴0.1％茚三酮酒精溶液，待酒精蒸发后烘干(注意勿着火)，观察出现颜色。三、黄色蛋白反应:验证蛋白质的某些侧链功能基团能发生黄色反应（与浓HNO3反应）。l、取1％卵清蛋白lml于溶液中，加浓硝酸（3－5）滴，此时出现蛋白质沉淀（为什么？），小心加热，观察沉淀颜色的变化。2、用自来水冷却试管，逐渐滴人40％NaOH溶液使之成为碱性，观察沉淀颜色的变化。四、作业：实验报告（二）氨基酸的纸层析法分离一、目的要求：1、掌握分配层析分离技术的原理。2、掌握用纸上分配层析法分析氨基酸的方法。二、教学方法和教学学时：1、教学方法：学生操作实验，教师指导。2、教学学时：2学时。三、实验内容：以滤纸及其结合水作为固定相，以有机溶剂（正丁醇：醋酸：乙醇：水=4：1：1：2）作为流动相，分离混合氨基酸样品，并鉴定其成分。四、结果与分析：用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的Rf值，与标准氨基酸的Rf值对照，确定水解液中含有哪些氨基酸。（一）实验结果混合样品标准氨基酸亮氨酸谷氨酸酪氨酸组氨酸Rf成分计算公式：（二）分析结果：五、注意事项1．点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）。2．点样斑点不能太大（直径应小于0.3cm），防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。3．展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。六、思考题1．为什么点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面？2．影响物质移动速率Rf值的因素有哪些？七、作业：完成实验报告实验三蛋白质的粗提及含量测定（考马斯亮蓝G-250法）一、目的要求：1、掌握蛋白质粗提方法。2、掌握考马斯亮蓝G－250法样品蛋白含量的原理。二、教学方法和教学学时：1、教学方法：学生操作实验，教师指导。2、教学学时：4学时。三、实验内容：1．蛋白质的粗提：2．样品中蛋白质含量的测定（1）标准曲线的制作取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。管号123456蛋白质标准液（ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250试剂（ml）555555蛋白质含量（μg）020406080100盖上塞子，摇匀。放置2min后在595nm波长下比色测定（比色应在lh内完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。（2）另取1支具塞试管，准确加入0.1ml样品提取液，再加入0.9ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595nm波长下比色，记录吸光度。四、结果处理根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：）（测定时取用提取液体积）样品鲜重（）提取液总体积（）查得的蛋白质含量（鲜重）样品蛋白质含量（mlgmlggg××=µµ/五、注意事项比色应在出现蓝色2min～lh内完成。六、思考题1．常用蛋白质的提取方法有哪些？各有何优缺点？2．考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？3．如何正确使用分光光度计？七、作业：完成实验报告。实验四还原糖和总糖含量的测定（3，5-二硝基水杨酸比色法）一、目的要求：1、掌握用硝基水杨酸比色法测定样品中总糖和还原糖含量。2、掌握总糖和还原糖的提取方法。二、教学方法和教学学时：1、教学方法：学生操作实验，教师指导。2、教学学时：5学时。三、实验内容：1、制作葡萄糖标准曲线2、以面粉为材料，500C水浴提取还原糖；用硝基水杨酸比色法测定出还原糖的含量。3、取食用面粉，酸解法制备总糖水解液；用硝基水杨酸比色法测定出总糖的含量。四、结果与分析：（一）糖的定量测定结果管号还原糖测定管号总糖测定管号①②III还原糖待测液（ml）11总糖待测液（ml）11蒸馏水（ml）11113,5-二硝基水杨酸(ml)1.51.51.51.5计算公式：100%××=）样品质量（测定时取用体积提取液总体积）（查曲线所得还原糖质量还原糖mgmg100%××=）样品质量（稀释倍数）糖质量（查曲线所得水解后还原总糖mgmg（二）结果分析：1、面粉中主要含有何种糖？2、在提取糖时，其他杂质是否会影响到测定？3、分析操作误差和偶然误差。五、注意事项标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。六、思考题1．可用不同材料，以比较含糖量的差异。2．面粉中主要含有何种糖？3．在提取糖时，其他杂质是否会影响到测定？七．作业：完成实验报告实验五过氧化氢酶活性的测定——碘量法一、目的要求：掌握过氧化氢酶活性的测定的原理及方法。二、教学方法和教学学时：1、教学方法：学生操作实验，教师指导。2、教学学时：4学时。三、实验内容：1、酶液的提取2、酶活力测定。四、结果与分析：（一）实验结果用空白滴定值减去样品滴定值即可求出此期间酶所分解的过氧化氢量。被分解的H2O2量(mg）＝[空白滴定值(ml)—样品滴定值(ml)]×硫代硫酸钠物质的量浓度×34.02）时间（）样品质量（）酶液总体积（）测定时用酶液量（）量（被分解的过氧化氢酶活性min22××=gmlmlmgOH式中：34.02为过氧化氢摩尔质量。（二）分析结果五、作业：实验报告。实验六维生素C的定量测定一、目的要求：掌握用2，6—二氯酚靛酚滴定法测定样品中VC的原理及方法。二、教学方法和教学学时：1、教学方法：学生操作实验，教师指导。2、教学学时：4学时。三、实验内容：以桔络、作实验样品，用10倍量的1%盐酸抽提（研磨），制得50ml抽提液；用1%盐酸作空白液。脉动和鲜橙多饮料，离心后的清液，过滤后作样品液；蒸馏水作空白液。用2，6—二氯酚靛酚滴定法测定该抽提液或样品液中VC的含量。1、提取用分析天平准确称取洗净风干的桔皮2g，放入研钵中研碎。加入5mL1％盐酸溶液仔细研磨。浆液经滤纸过滤到50mL容量瓶中。如此反复提取3－4次。最后用1％盐酸溶液定容至刻度并混匀。2、滴定将已标定的2，6—二氯酚靛酚溶液装入微量滴定管（5mL）内。取3只50mL锥形瓶，各加入10mL桔皮提取液。用微量滴定管内的染料溶液进行滴定。当滴定至提取液呈淡红色，并保持15秒内不褪色时，即为滴定终点。记录所消耗的2，6—二氯酚靛酚溶液的毫升数。另取3只锥形瓶，各加入10mL1％盐酸溶液如上作空白对照滴定。3、计算取滴定结果的平均值，按下式进行计算：21010050)(100/××××−WVbVagmgC桔皮）＝含量（维生素10050)(×××−WVbVa＝式中Va和Vb分别为滴定桔皮提取液和空白对照所消耗的染料溶液的平均毫升数；W为标定的每毫升染料溶液相当于维生素C的毫克数；50为桔皮提取液的总毫升数；10为滴定时所取的提取液的毫升数；2为桔皮的克数。四、结果与分析：五、注意事项滴定过程应迅速，不要超过2分钟。因为在本滴定条件下，一些非维生素C的还原物质的还原作用较慢，快速滴定可以避免或减少它们的影响。要使结果准确，滴定消耗的2，6—二氯酚靛酚溶液应在1－4mL之间。若超出此范围，则必须增减样品用量或者将提取液适当稀释。六、作业：实验报告。实验七葡聚糖凝胶柱层析法基本训练一、目的要求：1、学习与掌握凝胶层析分离的一般原理和操作方法。2、了解蓝色葡聚糖、细胞色素C、DNP—甘氨酸的基本性质。二、教学方法和教学学时：1、教学方法：学生操作实验，教师指导。2、教学学时：4学时。三、实验内容：葡聚糖凝胶G—50或G—100加水，沸水浴溶胀2hr，装柱，加样，洗脱与收集，绘制洗脱曲线。1、溶胀2、装柱洗净的层析柱应保持垂直位置，柱内先装入洗脱液，排除层析柱滤板下的空气，关闭出口。柱内留下约10mL洗脱液，加入搅拌均匀的葡聚糖凝胶G－50的浆液，打开柱底部出口，调节流速为0.3mL/min。凝胶颗粒随溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部。不断补入凝胶浆液，直到凝胶床高15cm为止。床面上保持有少量洗脱液，关闭出口。操作过程中应注意不能让凝胶床表面露出液面，并防止层析床内出现“纹路”。3、加样打开出口，使洗脱液凹液面恰好下降到床表面时，及时关闭出口。然后吸取0.5mL样品液，小心加于床表面成一薄层，切勿搅动床表面。小心打开出口，让样品液流入凝胶柱内。再用0.5－1mL洗脱液洗凝胶床表面2次，并使之完全进入凝胶柱内。注意每当液面降至床表面时，都要小心及时地加入洗脱液，以保持凝胶床面不露出液面。4、洗脱与收集当加样结束后，开始用洗脱液洗脱并收集流出液。调节洗脱液流速为0.3mL/min。先收集4mL后，再以每管0.3mL（约6滴）分部收集，观察并记录3种有色物质被分离的先后顺序和收集液颜色的深浅程度（以－、＋、＋＋、＋＋＋等符号表示）。5、绘制洗脱曲线以洗脱管数为横坐标，洗脱液颜色深浅为纵坐标，在坐标纸上绘制洗脱曲线。四、结果与分析：实验结果：图1洗脱曲线洗脱液颜色洗脱管数分析结果五、注意事项加样时，为了不让样品稀释，必须使洗脱液凹液面下降到与床表面相切。打开出口不容易控制，也可用滴管从上面吸取多余的洗脱液。六、作业：实验报告。