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不同植物样品可溶性蛋白含量和多肽组分的差异实验目的•掌握冷冻离心机的操作使用方法。•掌握植物可溶性蛋白的提取方法和原理。•掌握分光光度计的使用方法和原理。•掌握可溶性蛋白的定量测定方法和原理。•掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和基本操作过程。实验包括三个部分内容：一、不同植物样品可溶性蛋白的提取。二、植物可溶性蛋白含量的测定。三、聚丙烯凝胶电泳分离可溶性蛋白。一、不同植物样品可溶性蛋白的提取•原理植物材料中通常含有两类蛋白，一种是易溶于水主要存在于细胞基质、叶绿体基质和线粒体等细胞器基质中的可溶性蛋白，另一类是难溶于水主要存在于各种细胞器膜上的膜结合蛋白。将植物材料在一定的提取缓冲液和0～4℃低温下充分研磨，可溶性蛋白将溶解在提取缓冲液里，通过离心将未破碎细胞器和膜蛋白去除，得到的离心上清夜就是可溶性蛋白的粗提物。离心机基本原理⒈离心力（centrifugalforce，Fc）离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小等于离心加速度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：FC＝mω2X其中ω是旋转角速度，以弧度/秒为单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位；m是质量，以克为单位。⒉相对离心力（relativecentrifugalforce，RCF）由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。RCF＝F离心力/F重力＝mω2X/mg=1.118×10－5.N.XN（rpm）=RCF×105/（1.18×X）式中X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；N为转子每分钟的转数（rpm）。植物细胞破碎后通过差数离心形成的沉淀沉淀转速×时间内含物A150g×20min完整细胞B1000g×20min细胞核，细胞碎片C3000g×6min叶绿体D10000g×20min线粒体、溶酶体、微体E100500g×20min微粒体F100500g×20min＋0.26%脱氧胆酸核糖体实验注意事项：•整个操作过程在0－4℃低温下进行；•研磨必须充分；•加蛋白酶抑止剂（PMSF苯甲基磺酸氟）或抗氧化剂；•提取的蛋白一般需要分装后，在液氮或－80℃低温下保存。实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料自选植物材料，至少三种以上处理，例如：1、不同植物的叶片；2、同一植物的根、茎、叶、花等不同组织器官；3、同一植物不同发育状态如嫩叶、成熟叶和老叶；4、或者叶片用不同的高温处理等等。（二）试剂1．提取缓冲液：0.125mol的Tris-HCl,pH7.0，称取12.5gTris于烧杯，用适量双蒸水溶解，HCl调pH至7.0,定容至1000ml。2．聚乙烯吡咯烷酮（PVP）3．β-巯基乙醇（三）设备冷冻离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等准确称取0.5g植物材料，加入2ml预冷的提取缓冲液，0.1g聚乙烯吡咯烷酮PVP和50μl的β-巯基乙醇，置冰浴研磨匀浆后,转移到10ml塑料离心管，用3ml提取液分两次洗涤研钵，提取液总体积5ml，10000g下离心10min，上清液为可溶性蛋白的粗提液。操作步骤二、植物可溶性蛋白含量的测定•原理•考马斯亮蓝G-250（Coomassiebrilliantblue，G-250）法是利用蛋白质-染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。•考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。•蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。试剂与仪器设备•冷冻离心机，研钵，烧杯，离心管，•（二）试剂•1.标准蛋白质溶液（100μg／mL牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL即可。•2.考马斯亮蓝试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入100mL85％（W／V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。•（三）仪器设备•分光光度计，烧杯，量瓶，移液管，试管等。操作步骤试剂管号123456标准蛋白质（mL）00.200.400.600.801.00蒸馏水量（mL）1.000.800.600.400.200蛋白质含量（μg）0204060801001.标准曲线的绘制取6支试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。2.样品测定吸取先前提取的可溶性蛋白提取液0.1mL（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复2－3次），加入0.9ml蒸馏水，加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。结果计算样品中的蛋白质含量＝（C×VT）/(VS×WF×1000)（mg/g）•式中：C——查标准曲线值，μg。•VT——提取液总体积,mL。•VS——测定时加样量,mL。•WF——样品鲜重,g。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离植物可溶性蛋白电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。电泳基本原理：电泳现象早在1808年就已经被发现,但电泳作为一种分离技术却是在1937年由瑞典科学家TiseliusA首先提出来的,并设计出世界上第一台自由电泳仪,建立了移界电泳分离模式.他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动,首先证明了血清是由白蛋白,α1,α2,β和γ球蛋白组成的,为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献,1948年他被授予诺贝尔奖.COO-COO-COOH╱+H+╱+H+╱Pr←————→Pr←————→Pr╲+OH-╲+OH-╲NH2NH3+NH3+PHPIPH=PIPHPI电泳用于分离物质的原理：一、电荷的来源二、泳动度电场力F=EQ阻力F’=6πγηυ当带电颗粒受到的电场力和阻力平衡时，带电颗粒匀速运动:F=F’QE=6πηγνν/E=Q/6πηγ带电颗粒在电场作用下所受的力：在实验中，不同的带电粒子被分离，即在同一电场条件下粒子所处的位置不一样，即电泳距离d不同。ν/E用U表示，称泳动度或迁移率（mobility）即单位电场强度时粒子运动的速度，取决于带电粒子的电荷量Q、粒子大小γ和形状。三、影响电泳速度的因素•样品本身：带电量，分子大小，形状•电场强度：电压•缓冲液pH•缓冲液离子强度•电渗作用•对电泳支持物的选择•温度（1）样品本身：带电量、分子大小、形状。Q越多，V越大；r越小，V越大；球形分子纤维状（2）电场强度：E越大，V越大（3）缓冲液pH：pH决定Q，(pH-PI)越大，Q越多，V越大；成分：性质稳定，不易电解。（4）缓冲液离子强度：最合适的离子强度应该在0.02-0.2M之间。缓冲液离子强度越大，样品电流减小，V变小；缓冲液离子强度越小，样品电流越大，V越大，但样品易扩散。（5）电渗现象：液体对固体的相对移动，由缓冲液的水分子和支持介质的表面之间所产生的一种相关电荷所引起。电渗与电泳方向相同，V变大；反之变小。（6）支持介质：惰性材料，有一定坚韧度，可以保存；吸附力要小；无电渗作用（7）温度：过高，由于产热增加、水分蒸发，对电泳不利。电泳的分类一、按分离的原理分类1、区带电泳不同的组分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，用光密度计扫描可得到一个个互相分离的峰。电泳的区带随时间延长和距离加大而扩散严重，影响分辨率。加不同的介质可减少扩散，特别是在凝胶中进行，它兼具分子筛的作用，分辨率大大提高，是应用最广泛的电泳技术。2、移界电泳把电场加在生物大分子溶液和缓冲溶液之间的界面上,带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动。它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得到一个个台阶状的图形，最前面的成分有部分是纯的，其他则互相重叠。其是Tiselius最早建立的电泳方法。3、等速电泳在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按距离对浓度作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。4、等电聚焦电泳由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成PH梯度，被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率高。二、按有无固体支持物分类1、自由电泳•显微电泳•移界电泳•柱电泳•自由流动幕电泳•等速电泳2、支持物电泳（1）无阻滞的支持物•纸电泳•醋酸纤维薄膜电泳•薄层电泳（2）凝胶电泳•淀粉凝胶电泳•聚丙烯酰胺凝胶电泳•琼脂糖凝胶电泳1.连续电泳：缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。2.不连续电泳：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。三、根据电泳的过程的连续性分为分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。浓缩效应：样品在电泳的过程中被浓缩成高浓度的薄层。四、根据电压的高低分•常压电泳（100－500V）•高压电泳（500V以上）五、根据电泳槽的形状分•垂直电泳•水平电泳•柱状（圆盘）电泳•毛细管电泳原理：以醋酸纤维薄膜为支持物，在pH=8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白的PI均小于8.6，带负电荷，电泳时向正极移动。由于迁移率不同而被分离。一、醋酸纤维薄膜电泳（celluloseacetatemembraneelectrophoresis）醋酸纤维薄膜是一种由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中，如血清蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、类固醇及同工酶等。它具有简单快速等优点，电渗作用虽然较高但很均一，不影响样品的分离效果。不足之处是分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，由于薄膜厚度小（约10～100μm），样品用量很少，不适于制备。结果示意图：γβα2α1清蛋白（一）实验原理：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N—tetramethylethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）•Acr和Bis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数为凝胶浓度，用T%表示。凝胶溶液中交联剂占单体加交联剂总量的百分数