7液相色谱法

第七章：高效液相色谱法学习要求了解高效液相色谱法的主要类型；熟悉高效液相色谱仪的基本结构；掌握高效液相色谱法的基本理论、定性与定量方法。1第一节：概述高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。2第一节：概述经典液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9107Pa);色谱柱以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万)；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。3第一节：概述一、液相色谱与气相色谱的比较液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论（塔板理论与速率方程）也与气相色谱基本一致。在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，液体和气体的性质不相同；液相色谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：4第一节：概述1.应用范围不同气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，只有大约20%的有机物能用气相色谱分析。液相色谱不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70～80%。5第一节：概述2.液相色谱能完成难度较高的分离工作气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。在液相色谱中流动相液体与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。6第一节：概述液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱较少，选择面窄。液相色谱通常在室温下操作。可在较低的温度下进行，一般有利于色谱分离条件的选择。7第一节：概述3.液体的扩散性比气体的小105倍，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。4.液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。5.液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。8第一节：概述综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。9第二节:高效液相色谱仪二、液相色谱分离原理及分类分离的实质是样品分子(溶质)与溶剂(流动相或洗脱液)以及固定相分子间的作用。作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。10第二节:高效液相色谱仪液相色谱分离系统由两相：固定相和流动相。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。11第二节:高效液相色谱仪高效液相色谱仪由：高压输液系统进样系统分离系统检测系统控制、记录、数据处理系统等五大部分组成（P183）。12第二节:高效液相色谱仪构成HPLC的关键部件泵色谱柱检测器13第二节:高效液相色谱仪一、高压输液系统高压输液系统的组成：溶剂贮存器高压输液泵过滤器梯度洗脱装置14第二节:高效液相色谱仪1.溶剂贮存器溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。2.高压输液泵高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。15第二节:高效液相色谱仪高压输液泵，按其性质可分为两大类：恒流泵（往复式柱塞泵）P184图6-4能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。恒压泵（气动放大泵）P184图6-3保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。16第二节:高效液相色谱仪对泵的要求：输出压力高（35－50MPa/cm2);流量范围大（0.001－10mL/min)；流量恒定，无脉动；流量精度和重复性为0.5%－1%左右；耐腐蚀，密封性好。17第二节:高效液相色谱仪3.过滤器在高压输液泵的进口、出口与进样阀之间设置过滤器。18溶剂过滤器管道过滤器过滤芯片过滤片第二节:高效液相色谱仪4.梯度洗脱装置在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。低压梯度装置（外梯度）流动相在常温常压下混合，用高压泵泵入色谱柱系统，仅需一台泵即可。高压梯度装置（内梯度）将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。19第二节:高效液相色谱仪二、进样系统进样系统包括进样口、注射器和进样阀等。作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。20第二节:高效液相色谱仪三、分离系统(色谱柱)分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2～6mm，柱长为10～50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。21第二节:高效液相色谱仪四、检测器检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求：灵敏度高、可预测的响应，适用范围广，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。22第二节:高效液相色谱仪检测器的分类通用型检测器专用型检测器通常又分为溶质性检测器总体检测器23第二节:高效液相色谱仪常见的检测器：1.紫外－可见光检测器24第二节:高效液相色谱仪光电二极管阵列检测器检测得到的不再是单一波长的信号，而是在全部紫外波段上的色谱信号(立体图形)25第二节:高效液相色谱仪2.示差折光(折光指数)检测器定量分析的原理不同的溶剂以及含有不同溶质的溶剂具有不同的光折射。溶液的光折射率是溶剂(流动相)和溶质各自的折射率乘以物质的量浓度之和。溶有样品的流动相和流动相本身之间的光折射率之差即表示样品在流动相中的浓度。26第二节:高效液相色谱仪27第二节:高效液相色谱仪示差折光检测器类型：反射式(HPLC)偏转式干涉式克里斯琴效应式28第二节:高效液相色谱仪3.荧光检测器物质被光照射后吸收一定波长的光，原子子中的某些电子从基态中最低振动能级跃迁到较高电子能态的某些振动能级，由于电子在分子中碰撞，损失一定能量而下降到第一电子激发态的最低振动能级，当再跃迁回到基态的某些振动能级，同时发射出比原来所吸收的光频率低、波长较长的光，即荧光。荧光的强度与入射光强度、样品浓度成正比。适用范围：适合芳香烃族、生化物质的测定，如有机胺、维生素、激素、酶等的测定。29第二节:高效液相色谱仪荧光检测器结构示意图30第二节:高效液相色谱仪4.蒸发激光散射检测器(ELSD)原理经色谱柱分离后的流出物被高速载气喷成雾状液滴，在蒸发漂移管中流动相不断蒸发，溶质形成不挥发的微小颗粒，在检测器中，由于光照射在微小颗粒发生光散射。光散射程度取决于溶质的颗粒的粒度和数量，从而进行定量。31第二节:高效液相色谱仪蒸发激光散射检测器结构示意图32第二节:高效液相色谱仪5.馏分收集器无组分流出时，通往冲洗液回收瓶的切换阀导通，回收部分冲洗液，当组分流出时，切换阀导通通往收集试管的管道，收集分离的组分，收集完毕，在另一组分未流出时，切换阀回答开始状态，依次类推，直到各组分收集完毕。33第二节:高效液相色谱仪五、控制、记录和数据处理系统34N2010色谱数据工作站N3000双通道色谱工作站CDMC-21色谱工作站(双通道)第二节:高效液相色谱仪色谱工作站35第三节:高效液相色谱的固定相和流动相一、固定相（一）以承受高压能力来分类：1.刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0108～1.0109Pa的高压，制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。36第三节:高效液相色谱的固定相和流动相2.硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。（二）固定相按孔隙深度分类可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类：表面多孔型固定相全多孔型固定相37第三节:高效液相色谱的固定相和流动相1.表面多孔型固定相基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。38第三节:高效液相色谱的固定相和流动相2.全多孔型固定相由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。固定相由于颗粒很细（5～10m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。39第三节:高效液相色谱的固定相和流动相（三）化学键合相色谱70年代初发展了一种新型的固定相—化学键合固定相。固定相是通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶(载体)表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相。这不仅避免了液体固定相流失的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了分离的选择性。40第三节:高效液相色谱的固定相和流动相1.化学键合色谱的优点适用于分离几乎所有类型的化合物通过控制化学键合反应，可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选择性；通过改变流动相的组成和种类来有效地分离非极性、极性和离子型化合物。41第三节:高效液相色谱的固定相和流动相键合到载体上的基团不易被剪切而流失，不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。42第三节:高效液相色谱的固定相和流动相2.化学键合色谱分类根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键合相色谱分为极性键合相色谱和非极性键合相色谱。在极性键合相色谱中，流动相的极性比固定相极性要小，所以极性键合相色谱属于正相色谱。弱极性键合相既可作为正相色谱，也可作为反相色谱。通常所说的反相色谱系指非极性键合色谱。反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛。43第三节:高效液相色谱的固定相和流动相3.化学键合的固定方法化学键合固定相一般都采用硅胶(薄壳型或全多孔微粒型)为基体。在键合反应之前，对硅胶进行酸洗、中和、干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应，制备化学键合固定相。44第三节:高效液相色谱的固定相和流动相4.化学键合相固定相可分为四种键型硅酸酯型（=Si-O-C=）硅氮型（=Si-N=）硅碳型（=Si-C=）硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）45第三节:高效液相色谱的固定相和流动相（1）硅酸酯型（=Si-O-C=）键合相将醇与硅胶表面的羟基进行酯化反应，在硅胶表面形