生物化学教案9

基因信息的传递第三篇ThebiochemistryandmolecularbiologydepartmentofCMU基因(gene)：为蛋白质或RNA编码的DNA功能片段，是以碱基排列顺序的方式储存的遗传信息。基因组（genome)：某一物种拥有的全部遗传物质，从分子意义上说，是指全部DNA序列。转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录*中心法则(thecentraldogma)转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录主要内容●DNA的生物合成——复制●RNA的生物合成——转录●蛋白质的生物合成——翻译●基因表达调控●基因重组与基因工程DNA的生物合成(复制)DNABiosynthesis(Replication)第九章DNA的生物合成复制(replication)：以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制逆转录复制亲代DNA子代DNA本章主要内容：•复制的基本规律•DNA复制的酶学和拓扑学变化•复制的过程•逆转录和其他复制方式•DNA损伤(突变)与修复复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication第一节半保留复制(semi-conservativereplication)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)方向性和高保真性DNA复制的特征一、半保留复制的实验依据和意义DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。•半保留复制的概念ATGCCGTA亲代DNATCGAAGCTAGCTTCGA子代DNA全保留式半保留式混合式DNA复制的三种可能方式DNA半保留复制实验含N15-DNA的细菌培养于普通培养液第一代继续培养于普通培养液第二代梯度离心结果按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。•半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。原核生物：•基因组是环状DNA•只有一个复制起始点复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸相反的复制叉，称为双向复制。二、双向复制复制时双链打开，分开成两股，各自作为模板，子链沿模板延长所形成的Y字形的结构称为复制叉(replicationfork)。3'5'5'3'5'3'5'3'复制方向在原核生物双向复制中，DNA被描述为眼睛状。为说明方便而做的图为形。复制中的放射自显影图象oriC真核生物：•染色体DNA有多个复制起始点。•两个起始点之间的DNA片段称为复制子(replicon)。•复制子是独立完成复制的功能单位。真核生物多个复制起始点、复制子与复制叉真核生物的多复制子复制电镜图3535解链方向领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)三、复制的半不连续性顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。冈崎片段：•1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。•原核生物:1000~2000个核苷酸•真核生物:100~200个核苷酸半不连续复制动画DNA复制的酶学TheEnzymologyofDNAReplication第二节DNA复制的体系底物:dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)聚合酶:依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)模板:解开成单链的DNA母链引物:提供3'-OH末端的寡核苷酸其他酶和蛋白质因子:拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶一、复制的化学反应(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi•聚合反应的特点DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5→3方向进行。二、DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1.53的聚合活性2.核酸外切酶活性1959年获诺贝尔生理学或医学奖奥乔亚科恩伯格SeveroOchoaArthurKornberg聚合反应机理3535聚合反应的特点•以单链DNA为模板•以dNTP为原料•引物提供3'-OH•聚合方向为5'→3'•遵守碱基互补规律5´AGCTTCAGGATA3´|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´•35外切酶活性•53外切酶活性?能切除引物和突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。•核酸外切酶活性（一）原核生物的DNA聚合酶•DNA-polⅠ•DNA-polⅡ•DNA-polⅢ•DNA-polⅣ•DNA-polⅤ催化DNA聚合参与DNA损伤的应急状态修复校读、修复合成、切除引物填补空隙功能2040400分子数/细胞1011亚基数－－+5外切酶活性+++5外切酶活性+++5聚合酶活性polIIIpolIIpolIE.Coli中的DNA聚合酶功能：校读，去除RNA引物，填补空隙，参与DNA损伤修复。DNA-polⅠ323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段604个氨基酸DNA聚合酶活性5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ•Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。DNA聚合酶II(DNA-polII)•具有5′→3′的聚合酶活性。•只是在无polⅠ及polⅢ的情况下暂时起作用。•对模板的特异性不高,参与DNA损伤的应急状态修复。DNA聚合酶III(DNA-polIII)是复制延长中真正起催化作用的酶。由10种亚基组成不对称的聚合体。α，ε，θ亚基组成核心酶，α亚基具有5'→3'的聚合活性，ε亚基具有3'→5'外切酶活性，θ亚基可能起组装作用。β亚基(DNA夹子)能夹稳模板链，负责酶沿DNA模板滑动的作用。其余亚基统称为γ-复合物,是DNA夹子加载蛋白。εεDNA-polⅢ（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引发，有引物酶活性。复制的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol三、复制保真性的酶学依据•复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。•复制保真性的酶学机制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和即时校读（二）复制的保真性和碱基选择（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和即时校读（二）复制的保真性和碱基选择•DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。•嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的即时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制四、复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白理顺DNA链拓扑异构酶(gyrA,B)稳定已解开的单链单链DNA结合蛋白SSB催化RNA引物生成引物酶DnaG(dnaG)运送和协同DnaBDnaC(dnaC)解开DNA双链解螺旋酶DnaB(dnaB)辨认起始点DnaA(dnaA)蛋白质（基因）通用名功能原核生物复制起始的相关蛋白质E.Coli基因图•解螺旋酶(helicase)又称解链酶或rep蛋白•利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。DnaBDnaC解链方向单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性。DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)108局部解链后拓扑是指物体或图像作弹性位移而又保持不变的性质。解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。•拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键克服解链过程中的打结、缠绕现象拓扑异构酶Ⅰ拓扑异构酶Ⅱ•分类拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。（主要）•作用机制拓扑异构酶Ⅰ的作用拓扑异构酶Ⅱ的作用解旋解链酶类的作用引物酶(primase)依赖DNA的RNA聚合酶。对利福平不敏感。可以催化游离NTP聚合。在大肠杆菌，是dnaG基因的表达产物。催化RNA引物的生成。引物（primer）：是由引物酶催化生成的短链RNA，它可为DNA聚合提供3'-OH末端。五、DNA连接酶连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。POO-O-OHO5’POO-O-O3’3’5’DNA连接酶ATP（NAD+）AMP5’3’5’3’•在复制中起接合双链中单链缺口的作用。•在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。•是基因工程的重要工具酶之一。DNA连接酶的功能DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication第三节（一）复制的起始需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端;形成引发体。一、原核生物的DNA生物合成GATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···531.DNA解链E.coli复制起始点oriC11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串联重复序列反向重复序列53DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶SSB35352.引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物DNA解成单链由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶解开双链，SSB结合到单链上使其稳定。（二）复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol领头链的合成随从链的合成复制过程简图复制过程动画•原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。E.colioriter8232oriterSV40500（三）复制的终止555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPAMP+PPi55DNA连接酶•随从链上不连续性片段的连接哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成•细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。•蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。•真核生物每个染色体有多