生物化学教研室

生物化学教研室朱欣婷实验二改良的微量凯氏定氮法测定血清蛋白质含量生物化学教研室朱欣婷前言•蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。还有二种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）和BCA法。生物化学教研室朱欣婷由实验题目引发的思考？实验思路蛋白质的理化性质有哪些？蛋白质的测定方法有哪些？本次实验利用了哪个性质？生物化学教研室朱欣婷1.学习微量凯氏定氮法的原理。2.掌握721型分光光度计的使用。生物化学教研室朱欣婷蛋白质是机体内主要的含氮化合物，血清中含有蛋白质，也含有少量的非蛋白质含氮化合物。根据蛋白质中氮元素含量相当恒定（一般平均为16％）这一特点即可得到血清蛋白质含量。血清总含氮量－非蛋白含氮量＝血清中蛋白质含氮量生物化学教研室朱欣婷血清总含氮量?非蛋白含氮量?生物化学教研室朱欣婷血清总含氮量1.氧化并固定有机氮质（消化）硫酸亚硒酸加热含氮有机化合物NH3↑NH3↑＋CO2↑＋SO2↑＋H20↑2.显色,比色:（NH4）2SO4与碱性钠氏试剂作用（NH4）2SO4＋2NaOH→Na2SO4＋2NH4OH2NH4OH＋(KI2)·HgI2→NH2Hg2I3＋4KI＋NH4I＋2H20生物化学教研室朱欣婷血清中非蛋白氮Na2WO4＋H2SO4→H2WO4＋Na2SO41.制备无蛋白血滤液（钨酸法）2.消化后，经显色比色获得实验数据H2WO4使蛋白质变性获得沉淀，过滤后得无蛋白血滤液血清中含有非蛋白质的含氮化合物（如尿素、尿酸、肌酐、肌酸、氮、氨基酸等），其中所含的氮称为非蛋白氮（Nonproteinnitrogen）通常简写为NPN.生物化学教研室朱欣婷1、无蛋白滤液的制备取血清0.25ml置于中试管中加蒸馏水4.00ml混匀加10％钨酸钠0.25ml混匀加1/3mol·L-1硫酸0.25ml混匀后静置5分钟过滤制备无蛋白血液生物化学教研室朱欣婷2、稀释血清的制备(由教师准备，学生无需操作)取血清0.25ml100ml容量瓶中加蒸馏水至刻度生物化学教研室朱欣婷3、消化稀释血清1.00ml无蛋白滤液1.00ml置于硬质管中加消化液0.20ml冷却后显色木夹夹住，距管口1/3～2/3交界处于外焰均热后加热5～8分钟无→黑白烟→棕色→无色各加一粒玻璃珠生物化学教研室朱欣婷4、显色测定NPN标准空白硫酸铵标准液（0.04mgN/ml）－－1.00－消化液ml－－0.200.20蒸馏水ml6.906.905.806.80纳氏试剂ml3.003.003.003.005、比色（440nm），记录数据。生物化学教研室朱欣婷计算公式：(1)每100ml血清总含氮量:（单位：gN/100ml）C测=A测/A标×C标×稀释倍数(2)每100ml血清非蛋白含氮量：（单位：gN/100ml）CNPN=ANPN/A标×C标×稀释倍数(3)每100ml血清蛋白含氮量：（单位：gN/100ml）Cpro=C测－CNPN(4)血清蛋白质含量：（单位：g/100ml）Cpro×6.25生物化学教研室朱欣婷1、各样品管加液顺序为：横向依次加入，每加一种试剂均需要充分混匀；2、避免试剂交叉污染；3、加热消化时试管管口不能对着自己或他人；4、回收玻璃珠；生物化学教研室朱欣婷•1、过滤无蛋白滤液前，滤纸是否可以预先湿润？为什么要制备无蛋白滤液？•2、无蛋白滤液如果不是无色透明，说明可能存在什么问题？•3、稀释血清及无蛋白滤液消化显色后所测的含氮量有何区别？•4、除采用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量以外？还可以利用哪些方法测定其含量，分别利用了蛋白质的什么性质。能否举出一、两种方法？思考生物化学教研室朱欣婷实验三血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳电泳法的原理P26-33实验三的原理与操作步骤生物化学教研室朱欣婷补充内容生物化学教研室朱欣婷一、微量凯氏定氮法测定蛋白质（1）消化：样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而pro则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。（2）显色、比色：硫酸氨与碱性的纳氏试剂作用生成棕色胶体溶液。同样处理标准硫酸氨溶液比色。（3）除去NPN的影响。（4）利用钨酸使蛋白质变性的原理制备无蛋白质滤液。（5）血清总氮量－NPN，根据蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。•灵敏度低，适用于0.2～1.0mg氮，误差为±2％费时。生物化学教研室朱欣婷二、双缩脲法（Biuret法）H2N-CO-NH2+NH2-CO-NH2→H2N-CO-NH-CO-NH2＋NH3双缩脲双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。本法测定蛋白质范围1-20mg生物化学教研室朱欣婷三、Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度•蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。•优点：是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10－20倍，较双缩脲法灵敏100倍。•缺点：其不足之处是此反应受多种因素干扰。生物化学教研室朱欣婷四、紫外分光光度法测定蛋白质浓度•由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。•利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。生物化学教研室朱欣婷五、考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度•考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。生物化学教研室朱欣婷六、BCA（Bicinchoninicacid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）•原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。生物化学教研室朱欣婷BCA的优点•准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/ml；MicroBCA试剂测定范围是0.5-20μg/ml•快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便•经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量•不受样品中离子型和非离子型去污剂影响•检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝