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诊断酶学目的要求：熟悉酶在体内的病生变化机制；掌握酶促反应动力学的基本原理及酶活性测定方法;掌握肝胆疾病的酶学指标应用与评价；第一节概述临床酶学：指临床实验室应用酶作为多种疾病的诊断、预防、治疗及预后评估的学科。包括基础酶学、诊断酶学、治疗酶学基础酶学：注重酶的动力学研究；诊断酶学：应用酶、酶试剂对疾病进行诊断；治疗酶学：利用酶制剂进行疾病治疗；一、复习酶的概念、结构与功能1.基本概念酶是活细胞的产物，是生物催化剂；生物催化剂的特性：（1）高度不稳定性；（2）催化效率极高；（3）高度特异性；（4）催化作用的可调节性；2.结构与功能（1）酶的化学组成单纯酶结合酶酶蛋白+辅助因子＝全酶辅基结合紧密辅酶结合疏松（2）酶的活性中心指酶分子表面的能与底物结合并起催化反应的特定区域，该区域由酶的必需基团所组成。酶的活性中心被占据或构象发生改变均可导致酶的催化效率下降或消失。二、血浆（清）酶分类1.血浆特异酶在血浆中发挥作用，其降低表示合成该酶的组织受损。2.非血浆特异酶在血浆中含量较低且无任何功能（1）外分泌酶来源于外分泌腺，其浓度与分泌的腺体功能有关（2）代谢酶存在于各种组织细胞，参与物质代谢；血清中大量出现时提示细胞受损；代谢酶分为：一般代谢酶器官特异性酶四、血清酶变化的病生机制过多细胞内酶生成过少变异K2K1K3组织间隙血管内K4K8抑制抑制酶激活酶激活变化变化K7K5K6图示说明：不同组织或器官中的酶进入血中的途径不同；不同的酶其清除方式不同；控制血清酶水平的因素：1.酶在细胞内的合成速度2.酶从细胞释入血清的速度取决于三个方面：细胞内外酶浓度差；酶蛋白分子量的大小；酶在细胞内的定位及存在形式；3.酶在细胞外间隙的分布和运送酶从胞内进入血液的途径：（1）直接进入血液（2）部分直接入血，部分进入组织间隙（3）经淋巴系统入血4.酶从血中清除的速度可用酶的半衰期表示*血清酶从血清中消失的速率因人不同，因酶而异，随疾病过程的不同时间而变化。5.其它注意激活剂或抑制剂对酶活性的影响五、其它影响血清酶的因素1.生理因素的影响性别、年龄、进食、运动、妊娠等2.测定方法的影响方法的不同（速率法、终点法）测定条件的不同单位的差异3.标本的影响（1）最好用血清（2）溶血的影响（3）尽快、及时分离（4）样品的存放4.其它因素对酶活性测定的影响（1）温度的影响（2）抑制剂的影响（3）样品中酶浓度的影响（4）反应体系中其它物质的影响其它酶和物质；工具酶的污染；非酶反应；容器的污染等。第二节酶活性测定的基本知识一、酶活性的概念酶活性即酶促反应速度（v）：指在规定的条件下，单位时间（t）内底物（s）的减少量或产物（p）的增加量。v＝-d[s]/dtv＝d[p]/dt注意：强调单位时间的变化量二、酶促反应进程时间t1.四个时期典型酶促反应历程：预孵育期---延滞期---线性期---非线性期（1）预孵育期：未开始反应之前于一定温度下孵育的时期（2）延滞期（a）：反应开始但还未出现明显变化的时期（3）线性期（b）：底物或产物的变化与时间成直线关系的时期（4）非线性期（c）：反应速度持续下降，底物或产物的变化与时间不成直线关系的时期2.酶促反应初速度通过酶活性测定酶的含量，是一种间接的测定方法；利用酶浓度[E]与酶促反应速度成正比；酶促反应速度指初速度；三、酶促反应底物动力学中间产物学说k1k2E+SESE+Pk-1研究影响酶促反应速度的因素应注意：（1）反应体系其它因素不变，只单独变动研究对象（2）所用速度为初速度1.底物浓度对酶促反应速度的影响Km[S]（1）一级反应指反应速度与底物浓度成正比V＝k[S]（2）零级反应指反应速度不受底物浓度影响，即与底物浓度无关时的反应V＝k[S]°＝k酶活性测定应在零级反应进行，此时的反应速度才能代表酶浓度。2.其它因素对酶促反应速度的影响（1）酶浓度的影响（2）pH的影响（3）温度的影响（4）激动剂、抑制剂的影响3.米氏方程：Vm[S]V＝Km+[S]当酶浓度不同时，可得到不同的Vm，当酶浓度固定下来时，则Vm为一常数。（1）米氏方程的讨论当[S]》Km时v=Vm，为零级反应当[S]《Km时v=Vm/Km·[S]，为一级反应当v=1/2·Vm时Km=[S]（2）Km的物理意义为速度常数的复合函数，代表三个方向；反映酶与底物的亲和力；为酶的特征性物理常数（3）Km的应用选择合适的底物浓度计算v能达到Vm的百分率确定酶的天然底物确定工具酶用量及鉴别酶（4）Vm的应用酶浓度一旦确定，Vm即为一常数；它代表酶完全被底物分子饱和时的反应速度；4.Km、Vm的测定（1）双倒数作图法对米氏方程两边取倒数；1/v为纵坐标，1/[s]为横坐标作图；注意：横、纵坐标的交点求出其Km和Vm；注意：Km、Vm的单位（2）直接线性作图法底物浓度标在X轴的负半轴；底物浓度与对应的反应速度连线所得交点坐标为（Km、Vm）;交点太多时可取中位数；以ALP磷酸苯二钠法为例介绍Km、Vm的测定（双倒数作图法和直接线性作图法）第三节酶活性测定方法及酶学分析类型概述酶浓度的测定方法：绝对定量法依据酶的本质是蛋白质相对定量法依据酶的催化活性及酶促反应速度酶测定技术：分光光度法、荧光法、测压法、旋光法、放射化学法、电化学法等一、酶活性测定方法酶活性测定法是间接（或相对）测定酶浓度的一种方法，它是建立在酶浓度[E]与反应产物[P]或底物[S]的变化成正比的基础之上，且不能受其它因素的影响，才能根据反应速度来表示酶浓度的大小。测定方法：固定时间法和连续监测法1.固定时间法又称定时法、终点法、两点法（1）定义将酶液在适当的缓冲系统中与底物保温一段时间后，终止酶促反应，通过适当的物理化学方法测定其中产物的生成量或底物的消耗量。（2）特点：必须保证酶与底物在所选定的温度下作用时间准确必须终止反应后，才能测定体系中产物或底物的变化量（3）优缺点优点：对仪器设备要求不高、试剂成本较低、适用于基层及大批量测定。缺点：不能了解酶促反应历程，无法保证测定是在线性期内进行；测定时间长，高活性时偏离较大。2.连续监测法又称速率法（1）定义在酶促反应的最适条件下，用物理、化学或酶促反应的分析方法来连续观察和记录不同反应时间内底物或产物的变化，计算出酶促反应初速度。（2）特点：不需终止酶促反应可动态观察整个反应历程，从而避开延滞期和非线性期反应时间短，测定的是初速度（3）优缺点在线性期内测定，结果准确，但对仪器设备要求较高（4）满足速率法测定的要求要求具有能够精确控制温度等反应条件；要求仪器具有恒温装置及自动监测功能；要求反应体系中底物或产物能够直接测定；3.分类直接法和间接法（1）直接法直接测定反应体系中产物的增加量或底物的消耗量。E底物产物（无色或无吸收）（有色或有吸收）如：LDH测定（2）间接法指在反应体系中加入某些试剂而不改变（或不影响）所测酶的活性，并可以产生被直接测定的物质的方法称为间接法。二、酶活性单位的表示及计算1.酶活性单位指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。（1）惯用单位如：卡门氏单位、金氏单位、苏氏单位（2）国际单位指在规定的条件下，每分钟催化1umol/L的底物发生转化的酶量。用U/L表示（3）Katal单位指在规定的条件下，每秒钟催化1mol/L的底物发生转化的酶量。用nkat/L表示国际单位与Katal单位的换算：1U/L＝16.67nkat/L2.酶活性单位的计算计算公式：／min×(V×106V—反应体系体积（ml）—摩尔吸光系数（L.cm-1.mol-1）v—样品量（ml）L—比色杯光径（cm）A／min—每分钟吸光度的变化106—将mol换算成公式中：是某一物质的特征性常数，但会受到外界条件的影响；为一常数，可用F表示因此：／min×F三、酶偶联测定法1.偶联反应原理在反应体系中加入酶试剂（如辅助酶、指示酶等）使其与待测酶偶联起来，称为酶偶联法。酶试剂---工具酶：指作为试剂用于测定待测物浓度或待测酶活性的酶称为工具酶。酶偶联反应的模式一：ExEiABPEx：待测酶；Ei：指示酶例如：AST测定ASTα-酮戊二酸+天门冬氨酸谷氨酸+草酰乙酸MDH草酰乙酸+NADH+H+苹果酸+NAD+酶偶联反应的模式二：ExEaEiABCPEx：待测酶；Ea：辅助酶；Ei：指示酶例如：CK测定CK磷酸肌酸+ADP肌酸+ATPHKATP+葡萄糖ADP+6-磷酸葡萄糖G-6-PD6-磷酸葡萄糖+NADP+6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+2.对偶联反应的要求偶联反应是利用指示酶的反应来间接推算出待测酶的活性，因此有明显的延滞期。要求：（1）待测酶的反应为限速反应（2）指示酶的反应必须是一级反应（3）指示酶反应条件与待测酶一致（4）反应必须避开延滞期3.工具酶与指示反应（1）定义指作为试剂用于测定待测物浓度或待测酶活性的酶。（2）要求容易获取、价格低廉具有一定的比活性（3）指示反应：①脱氢酶系统NAD(P)H340nm有吸收NAD(P)+340nm无吸收②氧化酶系统Trinder反应，主要用于测定代谢物第四节同工酶测定一、概念1.定义指同一种属中由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂交体，其理化性质及生物学性质不同但具有相同催化功能的一组酶，称为同工酶。同工酶在理化性质上的差异：①对底物的亲和性、特异性不同；②对抑制物可出现不同的反应；③对热的耐受性不同；同工酶在结构上的差异：酶蛋白的氨基酸组成或排列顺序2.应用（1）检测同工酶活性比只测总酶活性更具有脏器特异性和更高的灵敏度；如：LDH及LDH1和LDH5测定（2）检测同工酶能早期诊断疾病；如：CK与CK-MB测定3.同工酶的分析方法（1）电泳法常用，以偶氮染料和四唑盐应用较多；注意巨分子酶的影响；（2）免疫化学法常用免疫抑制法和免疫沉淀法免疫抑制法：利用同工酶的一种亚型与相应抗体结合后活性受抑，通过测定加或不加抗体前后样品中酶活性的改变进行计算。如：CK-MB测定采用足量CK-MM抗血清抑制其活性免疫沉淀法：利用抗原抗体形成复合物而沉淀，测定上清液中其它亚型的活性，利用总酶活性－上清液酶活性＝被测同工酶活性。沉淀形成过程缓慢，用时较长。其它免疫学法测定酶蛋白：成本较高（3）动力学分析法利用不同的同工酶对底物的亲和性不同，据Km值的不同进行分析；热失活分析；pH分析；二、以LDH同工酶为例介绍1.基本特征：乳酸脱氢酶（LDH）：催化丙酮酸和乳酸之间的还原与氧化反应；LDH是一组含Zn2+的酶类；由H亚基（心型）和M亚基（肌型）组成四聚体，形成五种结构不同的同工酶，分别是：H4H3MH2M2HM3M4LDH1LDH2LDH3LDH4LDH5H亚基：12号染色体的a基因编码；含酸性氨基酸较多；耐热、65ºC稳定；对乳酸的亲和力强；易受草酸的抑制；M亚基：11号染色体的b基因编码；含碱性氨基酸较多；耐热性较差，57ºC失活；对丙酮酸的亲和力较强；易受草酸和尿素的抑制；2.主要分布：以LDH1为主，主要存在于心肌、红细胞；以LDH5为主，主要存在于横纹肌和肝脏；以LDH3为主，主要存在于脾、肺等组织；LDH为冷变性酶（主要是LDH4、LDH5）需室温保存。3.临床应用（1）诊断心肌损伤（2）诊断肝脏疾病LDH总酶LDH1LDH5疾病↑↑↑N心肌损伤↑↑N↑肝脏疾病第五节体液中常见酶的测定一、肝酶谱1.ALT（1）ALT基本特征磷酸吡哆醛作为辅基与酶蛋白构成全酶；ALT分布广泛；肝细胞中的ALT主要存在于胞质；（2）临床应用ALT我国测定次数最多的酶；肝损伤的灵敏指标（检测阳性率可达80～100％）；急性肝炎时，其活性的高低与病情轻重相平行；ALT半衰期较长，为急性肝炎恢复期最后降至正常的酶类；中毒性、酒精性肝炎时ALT升高；慢性活动性肝炎时也呈中度升高；注意：ALT分布广泛，ALT升高不一定存在肝脏疾病，应对其进行具体分析；“酶胆分离”常作为肝坏死的先兆；ALT长期升高但肝脏病理检查无病理改变，预后较好；（3）测定方法常用：赖氏法速率