实验一细菌形态结构的观察

医学微生物学实验ExperimentofMedicalMicrobiology基础医学院病原生物学教研室基础医学实验教学中心病原生物学与免疫学实验室杨致邦2010.1教材高等医学院校基础医学实验教学系列教材≪病原生物学实验≫科学出版社，2008年6月主编杨致邦叶彬掌握病原生物学的基本方法与基本操作技术；强化实验室生物安全观念，掌握无菌操作技术；加深对病原生物学基本理论知识的理解与认识；培养独立操作、独立观察和思考、独立分析问题和解决实际问题的能力；增强科技创新能力；培养严谨的作风、科学的方法和严肃认真的工作态度。实验教学的目标临床医学本科实验内容及安排实验课的带教内容学时数显微镜录像1细菌形态观察4需要2细菌的生长现象与消毒灭菌4有3致病性球菌4需要有4肠道杆菌4有5白喉杆菌、厌氧菌4需要6四体、真菌、病毒4需要有临床药学本科实验内容及安排实验课的带教内容学时数显微镜录像1细菌形态观察4需要2细菌的生长现象与消毒灭菌4有3致病性球菌4需要有4药物的微生物检测45药物的敏感性实验46四体、真菌、病毒4需要有非临床医学本科实验内容及安排实验课内容学时数显微镜录像1细菌形态结构的观察4需要2细菌的生长现象与消毒灭菌4有3四体、真菌、病毒4需要有实验一细菌形态结构的观察ObserveonMorphologyandStructureofBacteria【目的要求】1.熟悉实验室生物安全规则,掌握无菌操作技术；2.掌握细菌标本革兰染色的操作步骤和方法；显微镜(油镜)下细菌形态的观察;革兰染色结果判断；3.掌握细菌的特殊结构（荚膜、鞭毛、芽孢）的形态特点。【实验内容】1.实验室生物安全规则(P3)；2.细菌标本革兰染色观察（Gram’sStain)(每人做）(P10)；3.复习显微镜(油镜)的使用(每人做）；4.细菌特殊结构（荚膜、鞭毛、芽胞）的观察（示教镜）(P104)。【实验材料】(1)菌种:葡萄球菌、大肠杆菌斜面培养物。(2)试剂:革兰染色液。(3)其他:生理盐水、载玻片、酒精灯、接种环、显微镜、香柏油、擦镜纸、二甲苯等。【实验方法】1．细菌涂片的制作步骤：涂片干燥固定注意点：1）无菌操作2）加生理盐水（固体培养物）生理盐水生理盐水生理盐水+++葡萄球菌大肠杆菌葡萄球菌+大肠杆菌载玻片2.革兰染色1)方法初染:结晶紫和碳酸氢钠各1～3滴,3s-5s，水冲净,甩干。媒染:碘液1～3滴,3s-5s秒钟，水冲净,甩干。脱色:95%乙醇数滴,5s-10s,水冲净,甩干。复染:稀释石炭酸复红液1～3滴,10s，水冲净,甩干。关键步骤：掌握脱色程度。【结果观察】指标:形态、染色性、排列。染色性判断：革兰阳性菌染成蓝紫色,革兰阴性菌染成红色。3.观察标本片自然干燥或在酒精灯火焰上烤干后,在涂菌处滴加1滴香柏油,油镜下观察。Gram’sStain,×1000葡萄球菌:革兰阳性球菌,成堆或呈葡萄状排列。大肠杆菌:革兰阴性杆菌,不规则分散排列。Gram’sStain,×10004.细菌特殊结构（荚膜、鞭毛、芽胞）的观察注意点：观察时只能动显微镜的微调,不要动位置。要求：画图记录。1）破伤风杆菌的芽胞:芽胞染色×1000鞭毛染色×10002)变形杆菌的鞭毛:3)肺炎链球菌的荚膜:荚膜染色×1000【实验注意点】1.生物安全、无菌操作,菌种管清理；2.显微镜(油镜)的使用——用后擦镜头；3.用过的载玻片放进有消毒水的玻缸。4.做好清洁卫生。【实验报告内容】1.细菌标本革兰染色观察（方法、结果画图、讨论）；2.细菌特殊结构（荚膜、鞭毛、芽胞）观察（画图）。【实验报告示范】实验一细菌形态结构的观察【实验内容】1.实验室生物安全规则（每人掌握）；2.细菌标本革兰染色观察（Gram’sStain)(每人做）；3.复习显微镜(油镜)的使用(每人做）；4.细菌特殊结构（荚膜、鞭毛、芽胞）的观察（示教镜）。【实验材料和方法】一、细菌标本革兰染色观察1．细菌涂片的制作菌种：葡萄球菌、大肠杆菌斜面培养物方法：涂片干燥固定1）涂片：在酒精灯火焰旁用接种环无菌操作取生理盐水和葡萄球菌、大肠杆菌斜面培养物，涂抹、混匀于载玻片上，如下图：生理盐水生理盐水生理盐水+++葡萄球菌大肠杆菌葡萄球菌+大肠杆菌3）固定将载玻片以均匀的速度通过酒精灯火焰来回3次。2）干燥将涂片在酒精灯火焰上方约20cm高处烤干。2.革兰染色1)方法初染:结晶紫和碳酸氢钠各1～3滴,3s-5s，水冲净,甩干。媒染:碘液1～3滴,3s-5s秒钟，水冲净,甩干。脱色:95%乙醇数滴,5s-10s,水冲净,甩干。复染:稀释石炭酸复红液1～3滴,10s，水冲净,甩干。3.观察将标本片在酒精灯火焰上烤干后,在涂菌处滴加1滴香柏油,油镜下观察。4.结果见图1:葡萄球菌:革兰阳性球菌,成堆或呈葡萄状排列大肠杆菌:革兰阴性杆菌,不规则分散排列Gram’sStain,×1000图1：细菌标本革兰染色观察结果5.讨论本实验结果表明,通过革兰染色在油镜下可清楚地观察到标本片上细菌的形态、染色性和排列状态。革兰染色可将细菌分为2大类，即染成蓝紫色的革兰阳性菌和染成红色的革兰阴性菌。其原理是革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁结构的差异。结果不正确的影响因素分析：二、细菌特殊结构（荚膜、鞭毛、芽胞）的观察结果见图2-4。鞭毛染色×1000图2变形杆菌的鞭毛图3破伤风杆菌的芽胞芽胞染色×1000图4肺炎链球菌的荚膜荚膜染色×1000请班干部填写实验运行记录，安排做好清洁卫生。谢谢！