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生物堆肥的现状与发展前景丁宇摘要：综述了有机固体废弃物堆肥微生物学的研究方法的最新进展，以及堆肥过程中微生物的研究现状，提出了堆肥微生物学研究存在的主要问题和发展趋势。关键词：堆肥；微生物学；微生物；有机固体废弃物人类为满足自身活动的需要，在生产和生活过程中会产生大量的有机固体废弃物。这些有机固体废弃物主要包括农作物秸秆、畜禽粪便、城市生活垃圾以及污水处理厂污泥。随着其产量的不断增长，有机固体废物的累积和对环境污染的日趋严重，其处理处置已成为人类面的重要问题之一。堆肥作为一种保持良好环境效应的产物，具有生物处理的可持续性和废弃资源的循环利用等特征，已被许多国家和地区所接受，成为处理有机固体废物的有效方法之一。堆肥化的实质是微生物在适宜条件下的代谢作用。国内外学者对堆肥微生物学进行了广泛研究。微生物在堆肥过程中扮演着重要角色，不仅与堆肥周期、堆肥质量密切相关，还与臭味控制、氮损失紧密相关。因此，堆肥微生物学研究对开发堆肥微生物资源，加速堆肥过程，缩短堆肥周期，提高堆肥质量，减少堆肥过程中的氮损失、臭气挥发和产生具有重要意义。1堆肥微生物学研究方法分离、培养和生理生化鉴定是堆肥微生物学的传统研究方法。然而，微生物种类繁多，自然界中仅有极少数微生物得到鉴定，“存活而能培养”的种类至多为1％。近年来，随着研究手段的改善和研究方法的创新，一些新研究新方法应运而生，为堆肥微生物学的研究提供了新的途径。l，1分离培养方法传统培养分离方法是最早的认识微生物群落结构和多样性的方法，也是微生物学研究的经典方法，自1880年发明以来一直到现在仍被广泛使用。传统培养分离方法是将定量样品接种于培养基中，在一定的温度下培养一定的时问，然后对生长的菌落计数和计算含量，并通过在显微镜下观察其形态构造，结台培养分离过程生理生化特性的观察鉴定种属分类特性。冯明谦等研究了滚筒式高温堆肥过程中微生物种类和数量，分离鉴定了细菌5属20株、霉菌8属13株、放线菌1属3株、酵母菌2属2株。同时，结果表明，细菌和霉菌是堆肥过程中的优势类群，芽孢杆菌和曲霉菌是优势种。分离、培养的方法采用·定配比的培养基和固定的培养温度，忽略了气候变化和生物相互作用的影响，具有明显的人工选择性。由于分离、培养法具有选择性，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少，很有可能遗漏一些有意义的微生物。同时，也制约了人们对堆肥微生物学机理的深入了解。1．2分子生物学方法分子生物学技术是通过检测样晶中微生物特定的DNA或RNA片段来判断某种微生物的存在与否。自从Muyzer等首次报道了16SrDNA应用，该技术现已成为环境样品微生物多样性研究的重要工具。利用16srDNA进行微生物多样性研究具有有效、准确和偏好小等优点，引起了学者们的关注。随着提取和纯化环境微生物总DNA的方法的改善和发展，保证了列提取的环境样品总DNA进行扩增。VonWintzingemde等通过直接从样品中提取DNA进行分析发现，浚方法不仅DNA产量高，而且节约时间，比分离培养造成的偏好小得多。LaMontagne等证实了上述结果的可靠性。Howeler等对堆肥样品微生物DNA提取、纯化方法及其质量进行了定量分析，定量研究腐殖质污染对电泳和PcR扩增的影响及其消除方法，为堆肥样品DNA的提取和纯化提供了基本思路，也为后续研究奠定了技术基础。1．2．1PcR与DNA指纹技术聚合酶链反应(PcR)是一项能把靶DNA量扩增百万倍或更多的技术，它彻底改革了分子生物学的方法学。PcR在1985年首次被发现，现在已成为包括与环境微生物学相关的重要实验方法。可以扩增环境中少量的DNA这一能力使检出非常灵敏。环境微生物DNA提取物中是不同微生物DNA的混合物，经PcR扩增后，其产物是等长但不同源DNA片断的混合物。混合物中序列的多样性和不同序列的丰度在一定程度上反映了原始样品中微生物种群的多样性和不同物种的丰度。经过大量研究，现已有多种DNA指纹技术，如末端片断长度多态性分析(T—RFLP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)等。Tiquia等采用T—RFlP方法通过测度16srD·NA基因的多态性研究了堆肥过程中细菌群落结构。Kowalchuk等用DGGE法和竞争PCR法从不同的堆肥原料中得到了B—subgmupProteobacteria中含有的具有氨氧化样的16srRNA和rDNA序列。该研究小组2000年再次证实了PcRDGGE法的有效性和准确性。1．2．2．DNA序列测定与系统发育分析为了得到更为精确的分析序列，需要将PcR扩增产物克隆到载体中以构建文库。回收PCR扩增产物，将其克隆到载体中，经转化挑选并验证插入了目的片断。经验证后的克隆子利用ARDRA(AmplmedRibosomalDNArestrictionAnalysis)方法进行筛选。从克隆子中获取质粒DNA片断，可采用全细胞PcR扩增或质粒提取方法”1，但后者得到的质量较好。将上述得到的质粒进行测序，提交GenBank运行BLAsT程序与数据库中已知序列进行相似性比较。同时，还可利用theRibosomalDaLabasePmject提供的分析软件进行同源性分析。构建系统发育树(Phylogenetictree)常用到软件如MEGA和ARB。这两种软件可在相关数据库中得到。对食品废弃物堆肥过程中高温期的微生物多样性的研究结果显示，通过建立文库、DNA测序测定和系统发育分析，得到的22个16srDNA序列已在GenBank数据库登陆；通过同源性比较得到的9个高温菌、9个放线菌属在堆肥中均未见报道。schloss等跟踪研究了堆肥起始阶段微生物群落。所不同的是，扩增的片断为16s一23srRNA基因间隔区(AmsA)。1．2．3杂交技术核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种崭新的分子生物学技术。它是基于DNA分子碱基互补配对的原理，用特异性的cDNA探针与待测样品的DNA或RNA形成杂交分子的过程。由于它的高度特异性和灵敏性，近年来被广泛应用于微生物多样性的研究中。根据研究对象的rDNA序列或者相关数据库中的信息设计探针，探针的设计要求专一性较高。该技术可以在4个层次上对特定的微生物在环境中的存在、分布和丰度等进行研究。第一层次是直接在环境样品上进行原位杂交，通过原位杂交不仅可以测定不可培养微生物的形态特征及丰度，而且可以在原位分析其空间分布和动态。第二层次是与富集分离的菌落进行全细胞杂交。最初是以放射性标记的rRNA靶探针用于显微镜鉴定单个的微生物细胞。随着技术的发展，荧光标记的rRNA探针与流式细胞计可对混合的微生物种群进行自动分析。第三层次是与环境样品中的提取出的DNA和rRNA进行数量印迹杂交。第四层次是与rDNA的扩增产物或rRNA的反转录产物cDNA进行southem杂交。16srRNA基因探针研究堆肥过程中细菌群落的动态变化结果表明，细菌16srRNA基因探针开始时仅达到37％的靶目标，但随后在第84h样品中达到最大值83％。用假单胞菌属和低G+c含量的革兰氏阳性rRNA基因特异性探针得到相应的靶结合率在16％～87％之间。1．3生物标志物方法生物标志物(Biomakers)通常是微生物细胞的生化组成成分，其总量通常与相应生物量呈正相关。由于特定结构的标记物标志着特定类型的微生物，因此一些生物标记物的组成模式可作为指纹估价微生物群落结构。测定时，首先使用合适的提取剂提取环境微生物样品中的这些化合物并加以纯化，然后用合适的溶剂制成合适的样品用Gc或Lc检测，最后用统计方法对得到的生物标记物谱图进行定性定量分析。1．3．1生物醌技术微生物醌是能量代谢过程的电子传递体，不同的微生物含有不同种类和分子结构的醌。因此，环境样品中微生物醌的组成，即醌指纹可在一定程度上反映微生物的群体结构。泛醌与甲基萘醌的摩尔比在一定程度上可反映革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌之比，呼吸醌与光合型醌的摩尔比则可在一定程度上反映环境中细菌与藻类的比例。在一定条件下，微生物醌的含量相对稳定，故可利用微生物醌测定环境中的活性微生物的浓度。同时，根据微生物醌的摩尔组成还可计算出微生物的多样性和微生物种分布均匀性两个指标。用微生物醌指纹研究堆肥过程中微生物群落结构的变化结果表明，微生物量先升后降，而微生物群落多样性一直连续增加。在堆肥起始阶段存在真菌和Pmteobateria，在第3—7dBacillussspp。是主要的微生物种类，后期出现了多种Adf∞6耐硎n的繁殖，且通过总微生物醌(totalqllininecontent，TQ)和微生物醌的多样性(divergence0fquinmm，DQ)与理化参数，如c／N比、pH、耗氧量等指标具有很好的一致性。1．3．2磷脂脂肪酸分析磷脂脂肪酸（phospholipidfattyacid，PIJFA)谱图分析方法的原理基于磷脂几乎是所有生物细胞膜的重要组成部分，细胞中磷脂的含量在自然条件下(正常的生理条件下)恒定，其长链脂肪酸的形式——磷脂脂肪酸可作为微生物群落的标记物。此外，磷脂不能作为细胞的贮存物质，在细胞死亡后会很快降解，可以代表微生物群落中“存活”的那部分群体。PLFA方法适合跟踪研究微生物群落的动态变化，能够快速有效的从环境样品中提取大部分脂肪酸。Hemnann和shann利用肿A图谱分析了城市固体废物堆肥过程中微生物群落的变化。Klamer和Biith利用PLFA图谱技术研究了芒属草和猪粪混合堆肥过程中微生物量和微生物群落结构。结果表明，微生物量(用磷酸脂肪酸总量表示)在1d后达到峰值，约为堆肥起始时的6倍。堆肥温度也在ld后达到峰值(超过60℃)，随后逐渐下降到25℃。微生物量在此过程中也降到峰值的一半水平。革兰氏阳性菌在堆肥起始阶段随着堆肥温度的上升而迅速增加，随后随着堆肥温度的下降而逐渐减少。革兰氏阴性菌和真菌在堆肥温度达到约50℃之前增加，但是，在高温期反而减少。当堆肥温度由高温降至50℃时，二者又出现增加。放线菌在堆肥过程中始终数量不高，但在后期的堆肥过程中有所增加。2.堆肥过程中的微生物研究现状堆肥物料中一般均含有大量的土著微生物群。当适宜条件时，微生物迅速生长繁殖，中温微生物数量快速增长，堆肥温度随之上升；当达到不适于中温微生物生长繁殖的温度时，尽管中温微生物数景还会进一步增长，但其生长繁殖速度减慢或结束。这时，嗜热微生物逐渐取代中温微生物；同理，当温度过高时，也会抑制高温微生物数量的进一步增长。根据微生物活性，可将其在高温阶段的生长过程分为3个时期，即对数增长期、减速增长期和内源呼吸期。堆肥过程中，微生物演替迅速，温度在几天之内即可达到适宜的高温。由于受高温所限制，该阶段微生物群落的多样性相对较低，但微生物活性却较高。当堆肥物料中的可利用有机物耗尽时，微生物进入内源呼吸期，堆肥温度下降，中温微生物叉重新占据优势，腐殖质增多，堆肥产品达到稳定。甚至还会出现一些高级生物形式，如蚯蚓、昆虫、甲虫等，物种多样性开始恢复，此时堆肥生态系统成熟或达到顶级。2．1细菌细菌凭借其大的比表面积，可快速利用可溶性物质，在数量上通常要比体积更大的微生物(如真菌)多得多。有些细菌，例如芽孢杆菌，能形成很厚的孢子壁以抵抗高温、辐射和化学腐蚀等不良环境。芽孢杆菌属(bacillus)的一些种，如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌和环状芽孢杆菌是堆肥高温阶段的代表性细菌。嗜温细菌是堆肥系统中最主要的微生物。研究表明，在城市污泥堆肥过程的初始阶段，嗜温细菌最为话跃，其数量为8．5×108—5．8×109／g干重样品，随着温度达到最大值，其种群数量达到最低；在降温阶段，嗜温细菌的数量又有所回升。Beffa脑等曾经在堆肥过程中的高温期筛选出嗜热菌属，这些细菌能够在65℃以上，甚至高达82℃的垛温下生长。2．2真菌真菌，尤其是白腐真菌可以利用堆肥底物中所有的木质纤维素。嗜温性真菌地霉菌)和嗜热性真菌烟曲霉是堆肥生料中的优势种群，其他一些真菌，如担子菌、子囊菌、橙色嗜热子囊菌也具有较强的分解木质纤维素的能力。但随着温度的升高，真菌的菌落数开始减少，在64