2016年暑期分子生物学奥赛理论培训.

2016年暑期分子生物学奥赛理论培训辅导南京大学杨荣武一、DNA复制DNA复制的一般特征参与DNA复制的主要酶和蛋白质细菌与真核生物的DNA复制比较DNA复制的高度忠实性DNA复制的一般特征①以原来的DNA两条链作为模板，四种dNTP为前体，还需要Mg2＋②作为模板的DNA需要解链③半保留复制④需要引物——主要是RNA，少数是蛋白质⑤复制的方向始终是5′→3′⑥具有固定的起点⑦多为双向复制，少数为单向复制⑧半不连续性⑨具有高度的忠实性和进行性DNA复制可能的三种方式在复制叉中不连续合成的DNA片段称为冈崎片段，连续合成的DNA子链被称为前导链，不连续合成的DNA子链被称为后随链或滞后链。参与DNA复制的主要酶和蛋白质的结构与功能①DNA聚合酶②DNA解链酶③单链结合蛋白④DNA引发酶⑤DNA拓扑异构酶⑥DNA连接酶⑦端聚酶（真核生物特有）DNA聚合酶DNA聚合酶的全名是依赖于DNA的DNA聚合酶，就是以DNA为模板，催化DNA合成的聚合酶。DNA聚合酶是参与DNA复制的主要酶，该酶的许多性质直接决定了DNA复制的一些基本特征。DNA聚合酶反应通式：Mg2+DNA+引物-OH+dNTPDNA/引物-dNMP+PPi5′3′随后的PPi迅速水解驱动反应的进行细菌DNA聚合酶——DNApolI,II,III,IV和V真核生物DNA聚合酶——DNApolα,β,γ,δ和ε以及更多已在大肠杆菌中发现5种不同的DNA聚合酶1.DNAPI:切除引物和修复2.DNAPII:在DNA修复中起作用3.DNAPIII:主要的DNA复制酶4.DNAPIV:在DNA修复中起作用5.DNAPV:在DNA修复中起作用DNA聚合酶家族真核细胞的DNA聚合酶已在真核细胞中发现至少15种以上的DNA聚合酶，除了5种发现较早的DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε以外，其它几种DNA聚合酶如聚合酶θ、ζ、η、κ、ι、μ、λ、ψ和ξ都有相关的报道，这些新发现的DNA聚合酶一般缺乏3′-外切酶的活性（θ除外），因此没有校对的功能，它们主要参与DNA的跨越合成，以克服损伤对DNA复制的不利影响。端聚酶的结构与功能端聚酶也称为端粒酶，由蛋白质和RNA两种成分组成，其中蛋白质具有逆转录酶的活性，其三维结构与其它逆转录酶有明显的相似性，而RNA含有1.5拷贝的端粒DNA重复序列，这一部分序列作为逆转录酶的模板。不同来源的端聚酶在RNA长度上变化很大，但它们都形成特定的二级结构，作为模板的那一部分序列处于单链状态，以方便它与端粒区的重复序列结合，并有效地充当逆转录的模板。几种真核生物的端粒重复序列物种名称重复序列四膜虫、草履虫和纤毛虫T2G4酵母(TG)1~3TG2~3拟南芥T3AG3人T2AG3端聚酶的结构模型端聚酶的作用机理端粒酶活性与细胞分裂能力的关系细菌与真核细胞的DNA复制比较真核细胞的DNA复制在很多方面与细菌极为相似，但也有几点不同于细菌的地方：（1）需要解决核小体和染色质结构对DNA复制构成的障碍；（2）复制叉移动的速度远低于细菌；（3）具有多个复制子，这可以弥补复制叉移动速度低对整个DNA复制速度的制约；（4）冈崎片段的长度小于细菌；（5）复制被限制在细胞周期的S期，并受到严格的调控；（6）在第一轮复制结束之前不能进行第二轮复制，细菌在第一轮复制还没结束的时候就可以进行第二轮复制；（7）需要端聚酶解决染色体DNA末端复制问题（8）复制终止没有特定的像大肠杆菌Ter序列的终止区。古菌的DNA复制在DNA复制上，古菌与细菌相似的是，它也不需要也没有端聚酶，因为其染色体DNA是环状，无端粒结构，而在其他方面更像真核生物，主要表现在：①DNA模板与组蛋白形成核小体，而核小体结构对复制会产生一定影响；②许多古菌具有多个复制起始区；③参与复制的许多蛋白质和酶在结构与功能上非常接近真核生物。DNA复制的高度忠实性四种dNTPs浓度的平衡DNA聚合酶的高度选择性DNA聚合酶的自我校对错配修复使用RNA作为引物绝句复错不要紧，只要校对真，错了我一个，还有后来酶。DNA的损伤DNA的修复1.直接修复2.切除修复3.损伤跨越DNA的突变1.突变的类型与后果2.突变的原因3.回复突变与突变的校正二、DNA的损伤、修复和突变哪些因素能影响到DNA的完整性？细胞内源的因素环境因素-例如化学试剂、污染物和UV疾病治疗-例如离子辐射和化疗细胞内源因素复制错误-例如四种dNTP量的不平衡导致错配DNA本身的不稳定-碱基的自发脱氨基-DNA的脱嘌呤/脱嘧啶导致碱基脱落活性氧的作用-DNA,蛋白质和脂质的氧化环境（外源）因素化学试剂(1)天然化合物黄曲霉素(2)人造化合物苯并芘-香烟顺铂-化疗药物物理因素(1)UV(2)离子辐射γ-射线x-射线DNA损伤类型碱基修饰碱基丢失-无碱基位点复制错误：错误链断裂蛋白质-DNA交联DNA-DNA交联DNA损伤的因素和损伤的主要类型损伤类型实例/原因碱基丢失自发脱碱基（热、酸），脱嘌呤脱嘧啶，104嘌呤脱落/天/细胞（恒温动物）碱基修饰形成碱基加合物，例如，8-羟基脱氧鸟嘌呤（离子辐射或活性氧），6-烷基鸟嘌呤（烷基化试剂）碱基交联嘧啶二聚体和6-4光产物（UV）碱基转换C→U，A→I（自发脱氨基），100碱基脱氨基/天/细胞碱基错配GT（4种dNTP浓度不平衡、碱基的互变异构或碱基之间的差别不足）DNA链断裂因磷酸二酯键被破坏引起单链断裂或双链断裂（离子辐射或特殊的化学试剂），因脱氧核糖环3号位发生断裂引起的DNA链断裂（博来霉素）DNA链间交联互补双链之间产生交联（双功能试剂的作用）DNA与蛋白质的交联UV紫外线引起的碱基损伤DNA修复DNA是唯一一种在发生损伤以后可以被完全修复的分子，而其他生物大分子在受到损伤以后要么被降解，要么被取代。当然，并不是发生在DNA分子上的所有损伤都能修复。如果受到的损伤不能及时被修复，可导致细胞的癌变和早衰。细胞之所以在DNA受到损伤以后，选择的处理方法是尽量将其修复而不是将其降解，这一是因为作为遗传物质的DNA分子在细胞内只有一个拷贝，如果将其水解的话，细胞也就失去了存在的根基；二是DNA的互补双螺旋结构使得修复一个受损伤的DNA分子变得很容易。直接修复嘧啶二聚体的直接修复——由DNA光裂合酶催化。此酶直接识别和结合嘧啶二聚体。然后，利用辅基捕捉到的光能，将嘧啶二聚体打开，最后再与DNA解离。但是胎盘类哺乳动物却没有这种酶。烷基化碱基的直接修复——由特定的烷基转移酶催化DNA链断裂的直接修复——由DNA连接酶催化。嘧啶二聚体的直接修复烷基化碱基的直接修复切除修复切除修复先切除损伤的碱基或核苷酸，然后，重新合成正常的核苷酸，最后，再经连接酶重新连接，将原来的切口缝合。整个切除修复过程包括识别、切除、重新合成和重新连接。切除修复又分为碱基切除修复（BER）和核苷酸切除修复（NER），两者的主要差别在于识别损伤的机制上，前者是直接识别具体的受损伤的碱基，而后者并不识别具体的损伤，而是识别损伤对DNA双螺旋结构造成的扭曲。损伤跨越重组跨越使用同源重组的方法将DNA模板进行交换以避免损伤对复制的抑制，从而使复制能够继续下去，而随后的复制仍然使用细胞内高保真的聚合酶，因此忠实性并无下降，故此途径被视为一种无错的系统。跨越合成又称为跨损伤合成，由专门的DNA聚合酶与停留在损伤位点上的原来催化复制的DNA聚合酶交换，在子链上（模板链上损伤碱基的对面）插入正确或错误的核苷酸，结果导致对损伤位点无错或易错的跨越。SOS反应是指细胞在受到潜在致死性压力下，例如UV辐射、胸腺嘧啶饥饿、DNA修饰物的作用和DNA复制所必需的基因的失活，做出的有利于细胞生存的代谢预警反应，包括易错的跨损伤合成、细胞丝状化和切除修复的激活，其中涉及到近20个“sos”基因的表达。DNA的突变修复系统的不完善，为DNA的突变打开了方便之门，因为这些损伤如果在下一轮DNA复制之前还没有被修复的话，就有可能直接被固定下来传给子代，有的则通过易错的跨损伤合成产生新的错误并最终也被固定下来。这些发生在DNA分子上可遗传的结构变化通称为突变突变的类型点突变是指DNA分子某一位点上所发生的一种碱基对变成另外一种碱基对的突变，可分为转换和颠换两种形式，其中，转换是指两种嘌呤碱基或两种嘧啶碱基之间的相互转变，颠换是指嘌呤碱基和嘧啶碱基之间的互变移码突变是指在一个蛋白质基因的编码区发生的一个或多个核苷酸（非3的整数倍）的缺失或插入。碱基突变的几种方式点突变的后果突变的密码子决定同样的氨基酸，这样的突变对蛋白质的结构和功能不会产生任何影响，因此称为沉默突变。突变的密码子决定不同的氨基酸，这样的突变可能对蛋白质的功能不产生任何影响或影响微乎其微，也可能产生灾难性的后果而带来分子病。由于突变导致出现了错误的氨基酸，因此，这样的突变称为错义突变。如果错误的氨基酸与原来的氨基酸是同种性质，这种突变被称为中性突变。突变的密码子变为终止密码子或者相反，前者因为终止密码子的提前出现可导致一条多肽链被截短，被称为无义突变，后者则会加长一条多肽链，被称为加长突变或通读突变。隐性突变和显性突变DNA突变可能是隐性的，也可能是显性的。如果突变仅仅是灭活一种蛋白质，那么，这种突变一般产生隐性性状。如果突变产生的蛋白质对细胞有毒，这种毒性无法被另外一条染色体上正常基因表达出来的正常的蛋白质所抵消或中和，那么，这种突变被视为显性。突变的原因☺几乎任何导致DNA损伤的因素都能够导致DNA突变，前提是它们造成的损伤在DNA复制之前还没有被细胞内的修复系统修复，因此，可以这样认为，导致DNA损伤的原因在某种意义上就是导致DNA突变的原因。由内在因素引起的突变被称为自发性突变，由外在因素引发的突变被称为诱发突变。各种导致DNA突变的内外因素总称为突变原。导致自发点突变的原因自发的点突变（1）DNA复制过程中的错配（2）自发脱氨基（3）活性氧的氧化（4）碱基的烷基化自发的移码突变（1）“复制打滑”（2）转座作用。自发脱氨基和活性氧作用引起的碱基转换诱发突变诱发点突变1.碱基类似物，如5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤2.烷基化试剂，如氮芥和硫芥等3.脱氨基试剂，如亚硝酸4.羟胺诱发移码突变-嵌入试剂，如吖啶黄，原黄素和EB等诱变剂诱发的点突变三、DNA转录中心法则DNA转录的一般特征依赖DNA的RNA聚合酶启动子细菌与真核生物的DNA转录比较古菌的DNA转录中心法则-“一个中心（DNA），两个基本点（RNA和蛋白质”DNA转录与DNA复制的比较与DNA复制的共同性质1)需要模板、Mg2＋、解链和解除转录过程中形成的正超螺旋2)只能按照5′→3′的方向进行与DNA复制不同的性质1)不需要引物2)NTPs代替dNTPs;UTP代谢dTTP3)缺乏校对活性（错误率在1/104~1/105nts）4)发生在特定的区域（不是所有的DNA序列）5)对于一个特定的基因而言，只有一条链转录记住一些名称——模板链（无意义链，Watson链）和编码链（有意义链，Crick链）编码链，有意义链，Crick链模板链，无意义链，Watson链转录翻译RNA聚合酶*共同的性质-DNA模板：一条链被转录-底物：GTP,CTP,UTP,ATP-二价金属离子：Mg2+*与DNA聚合酶之间的主要差别细菌RNA聚合酶的结构与功能所有的三类RNA由同一种RNA聚合酶催化*全酶*核心酶：2,1,1,1ω*抑制剂：利福霉素和利链霉素真核细胞的RNA聚合酶真核细胞的RNA聚合酶出现了功能分工，不同性质的RNA由不同的RNA聚合酶催化转录，其细胞核具有三种RNA聚合酶，即RNA聚合酶I、II、和III，三者也分别被称为RNA聚合酶A、B和C，它们分别催化细胞核内的rRNA（5SrRNA除外）、mRNA（大多数microRNA和小RNA（tRNA和5SrRNA）的转录。除此以外，线粒体和叶绿体也含有RNA聚合酶。RNA聚合酶I