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生物復育土壤縮模中辛基苯酚之生物分解與菌相研究Degradationofoctylphenolandmicrobialcommunityinbioremediationmicrocosmscontainingthreeexogenousbacteria陳錫金2、宋秉育1、郭家倫1、曾迪華3、黃雪莉1*1.國立中央大學生命科學系2.美和技術學院生物科技系副教授3.國立中央大學環境工程研究所教授*通訊作者:slhuang@cc.ncu.edu.tw,03-4227151-65051摘要辛基苯酚(octylphenol,OP)為辛基苯酚聚氧乙基醇(octylphenolpolyethoxylates,OPEOn)界面活性劑分解之代謝產物，由於其易於環境中累積，並具有類雌激素之環境荷爾蒙活性，為一生態和環境危害物質，其難分解之特性更使其在環境保護範圍中漸受重視；本研究利用通氣和外加營養鹽之土壤縮模，探討外添加分解菌PseudomonasnitroreducensTX1、P.putidaTX2和Pseudomonassp.OP2對土壤中OP之分解與形成之微生物菌群。研究結果顯示，於外加10,000mg/kgOPEOn之縮模中添加菌株P.nitroreducensTX1的縮模，OP於20天後，累積至1200mg/kg，添加菌株P.putidaTX2之縮模，45天後OP之累積量減少50%，顯示菌株TX2在降解OPEOn的同時，並同時降解OP。土壤中多添加菌株Pseudomonassp.OP2約可於90天中提高15-20%的OP移除效果，分段置放PseudomonasnitroreducensTX1、P.putidaTX2和Pseudomonassp.OP2三株外添加菌株於土壤中，可達成約75%的OP分解量。土壤微生物菌相分析結果顯示，以Proteobacteria中的Pseudomonas、Aeromonas和Stenotrophomonas為主要菌屬，菌相中菌株Stenotrophomonasmaltophilia、Aeromonashydropila及Alcaligenesfaecalis在文獻中已顯示其具有分解芳香族化合物及APEOn相關化合物之能力，顯示OP之分解確實為微生物活動所形成，此外，外添加菌P.nitroreducensTX1和P.putidaTX2可於土壤中保持優勢生長，然而當菌株Pseudomonassp.OP2分別和菌株P.nitroreducensTX1及菌株P.putidaTX2一起放入土壤中時，由於菌株TX1的優勢生長，菌株OP2在約50天後才出現明顯的生長優勢。關鍵字：辛基苯酚聚氧乙基醇，辛基苯酚，環境荷爾蒙，生物分解，生物縮模，生物復育一、前言烷基苯酚聚氧乙基醇類(AlkylphenolPolyethoxylates,APEOn)化合物為常用的非離子性界面活性劑，其中壬基苯酚聚氧乙基醇類(NonylphenolPolyethoxylates,NPEOn)佔烷基苯酚聚氧乙基醇類總產量的80%，而辛基苯酚聚氧乙基醇類(OctylphenolPolyethoxylates,OPEOn)則約佔總產量的20%。APEOn於環境中降解時，會產生難分解之代謝產物蓄積於環境中，且這些代謝物，如Nonylphenol(NP),Octylphenol(OP)(NP與OP統稱為AP(烷基苯酚)),NonyphenolMonoethoxylate(NPEO1),OctylphenolMonoethoxylate(OPEO1)等類化合物，研究顯示其具有環境荷爾蒙的效應(Yingetal.,2002)，對生物體的影響更甚2COHCH3CH3CH2CH3CH3H3C於原物質。AP之所以可以模仿雌激素而與雌激素受體結合，主要的原因一是兩者之間皆存在有相同的酚(phenolic)結構（詳如Figure1），而此相似性可與雌激素受體產生兩個氫鍵之鍵結，就如同雌激素之A環上的-OH基一樣；而另一原因則是AP烷基鏈之存在，此部份結構之疏水性可提高AP和雌激素受體之間的疏水性親和力(hydrophobicaffinity)作用，一如雌激素與受體之疏水性作用，故當烷基鏈之碳數越多時，疏水性親和力越強，使得結合狀態更形穩定。因此造成NP和OP之環境荷爾蒙效應較酚更為顯著(Tanenbaumetal.,1998)。由活體試驗結果亦顯示NP及OP均有相似的雌性激素效應，NP為雌二醇的0.000030倍，而OP之雌性激素效應是壬基苯酚的10到20倍左右(LaGuardiaetal.,2001)故本研究採用OP為分解目標物。此外，研究指出，AP對魚類的急毒性，半致死濃度(LC50)為17~3000μg/L(以Pleuronectesamericanus為例)，對於無脊椎動物的LC50為20~3000μg/L(以Hyalellaazteca、Mytilusedulis等為例)，而對藻類則為27~2500μg/L(以Skeletonemacostatum、Chlamydomonassegnis等為例)(王正雄等人，2002)，此亦顯示此類APEOn代謝產物對環境之毒害。Figure1.StructureofOPEOn,OP,and17-estradiolandestrogenic-likealkylphenol-relatedcompounds:（A）17-estradiol,（B）nonylphenol,（C）octylphenol,（D）octylphenolmonoethoxylate.全球合成界面活性劑年產量超過7,200,000公噸，約30％為非離子性（其中的6％為烷基苯酚聚氧乙基醇類）、而台灣每年生產及使用此類界面活性劑約48,000公噸(Dingetal.,1999)。且由於OP具有比NP更高之環境賀爾蒙活性，且OP具有4級的分支烷鏈，非常不易分解。而NPEOn和NP之烷鏈則有不同組成的一混和物，因此，本研究群過去數年來，致力於OPEOn生物分解菌之篩選及生物分解生化特性之研究，根據過去數年之研究結果發現，篩選自土壤中之OPEOn分解菌與土壤原生菌，皆可有效降解OPEOn(Huangetal.,2004;Chenetal.,2004)，主要降解途徑為EO鏈之逐步轉化與分解，產物為OPEO3、OPEO2、OPEO1及OP。此一結果證實，OPEOn類化合物之環境生物代謝機轉，且會造成環境賀爾蒙物質的累積，為進一步探討環境賀爾蒙物質生物分解的可能性，我們以OP做為碳源，自土壤中篩選出可以以OP為碳源之微生物菌株，並以此菌株做為外添加菌，於本研究之復育縮膜中，探討土壤中OP分解菌之生物分解效果，並經由PCR及DNAcloning，探討土壤微生物分解OP之微生物菌相變化。因此，本研究之研究目的包括分析土壤中不同微生物對OP降解效果之影響，及探討土壤中OP分解之微生物菌相變化，並期待此一研究成果，能對環境賀爾蒙在土壤中生物分解效果之增進，並探討不同菌株之影響。HOHOHOOHOHO(A)(C)(B)(D)COCH2CH2OHnCH3CH3CH2CCH3CH3H3C3二、材料與方法2.1外添加分解菌本研究所使用之外添加菌株共有三株，分別是：(1)PseudomonasnitroreducensTX1(Chenetal.,2005):篩選自常受界面活性劑污染之排水溝底泥中，並以Biologmethod、16SrDNAsequenceanalysis及fattyacidmethylesteranalysis鑑定為PseudomonasnitroreducensTX1(Chenetal.,2006)，此菌並於美國菌株中心ATCC寄存(Huangetal.,2004;黃,2005)；(2)PseudomonasputidaTX2:篩選自先前OPEOn分解縮模中，經與菌株TX1相同之鑑定程序後，確認為Pseudomonasputida，命名為PseudomonasputidaTX2；(3)Pseudomonassp.OP2:篩選自先前OPEOn分解縮模中，經相同之鑑定方法，故命名為Pseudomonassp.OP2(謝孝正，2004)。以上菌株皆培養於MSB(MinimalSaltsBasal)培養(NguyenandSigoillot,1997)，將其接殖於10支5mlMSB溶液中，每支各含OPEOn及OP，以30℃，200rpm震盪培養，當微生物達late-log期，將菌液以10,000g離心10分鐘，離心後之菌體併同調節土壤含水率之土壤添加水，均勻混合加入土壤中。2.2土壤本研究之縮模所用土壤取自宜蘭縣員山鄉水稻田土壤，該土壤長久以來一直施用各式農藥如S-methyl-N((methylcarbonoyl)oxy)thioacetimidate,o,o-diethyl-o-(3.5.6-trichloro-2-pyridyl)phosphorothioateandbutyl(R)–2-(4-(5-trifluoromethyl-2-pyridyloxy)，並以界面活性劑NPEOn為農藥添加劑(展著劑)，因此本研究以此土壤為實驗對象，乃推測該土壤長期使用該類界面活性劑後，土壤中原生微生物，應具有一定程度，分解該類界面活性劑及其代謝產物之能力。土壤經採集後，破碎並以20mesh篩網過篩後，利用0.2M，pH7.35之鉀磷酸緩衝溶液，調節土壤至pH=7之中性環境，隨即加入縮模中。2.3土壤縮模土壤縮模設計，乃將600g水稻田土，置入體積為1280ml之錐形瓶中，用矽膠塞封口，以打氣機通入0.3liter/min之空氣進行縮模通氣，為減少水份散失，氣體通入土壤縮模前，先經一500ml蓄水瓶，瓶內裝入300ml超純水，並以0.22μm濾膜過濾空氣，以去除外在環境中微生物之干擾。土壤縮模系統操作條件示如Table1和Table2。操Table1.ThemicrocosmsforOPEOnand/orOPremediationwithadditionofthreeexogenousdegradersExogenousdegraders(dayadded)MicrocosmaTX1TX2OP2EndogenousmicroorganismbM4-1+(1)－－＋M4-2+(1)－+(21)＋M4-3－+(1)－＋M4-4－+(1)+(21)＋M4-5－－－＋M4-6－－－－aOPEOn(10,000mg/kgofsoil)wasaddedinallmicrocosmsb－:sterilizedat121,1.32kg/cm2for2hour℃s.+:noautoclavedThenitrogensourceis(NH4)2SO4intheconcentrationof3,200mg/kgofsoilinM4-1toM4-6.4作時間約100天，土壤含水率維持於50%，土壤原生菌滅菌組縮模土壤於121℃,1.32kg/cm2條件下，高溫高壓滅菌2小時。Table2.ThemicrocosmsforOPremediationwiththeadditionofPseudomonasspOP2.MicrocosmaPseudomonassp.OP2EndogenousmicroorganismbM5-1＋＋M5-2－＋M5-3－－aOP(3,000mg/kgofsoil)andthe(NH4)2SO4(960mg/kgofsoil)wereincludedineverymicrocosm.b－:sterilizedat121,1.32kg/cm2for2hour℃s.+:noautoclaved2.4OPEOn與OP之分析將2g土樣置入圓筒濾紙中，以200ml二氯甲烷與甲醇(50:50)混合液，在80℃水浴中，進行4小時索氏萃取(陳瑞玲，1996)，萃取液在50℃水浴溫度下，進行減壓濃縮至1ml樣品，以20ml氰甲烷沖洗出萃取物，再以0.45μm濾膜過濾後，4℃冷藏以備