生物学实验

分子生物学实验指导教师：石耀华海南大学海洋生物实验教学示范中心分子生物学实验多媒体课件简介分子生物学实验多媒体课件包括了分子生物学全部实验课程。为满足学生对《分子生物学》理论课中的基本概念、理论和知识要点的深入理解，以及灵活运用所学的知识指导实验设计和操作的需要，特编写本课件。课件包括水产动物DNA提取、水产动物RNA提取、质粒DNA提取、DNA聚合酶链式反应(PCR)、大肠杆菌感受态细胞的制备、质粒转化、钙调蛋白提取与聚丙烯酰胺凝胶电泳共七个实验。采用图文结合、实践和理论结合、抽象和感性结合方式，介绍了实验目的、设备仪器与材料、基本技术和操作技能，便于学生理解和掌握。实验一水产动物DNA提取一、实验目的学习动物总DNA的抽提方法和基本原理掌握DNA琼脂糖凝胶电泳技术二、实验材料和用品离心机、灭菌锅、水浴锅、移液器、制胶盘、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉等实验仪器设备：试剂：抽提缓冲液〔STE、1%2-巯基乙醇〕、蛋白酶K、10%SDS、饱和酚、氯仿、乙醇、异戊醇、TBE、DNAMarker、溴化乙啶(EB)、琼脂糖等三、实验原理DNA提取原理：十二烷基硫酸钠(SDS)是去污剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。蛋白酶K消化细胞后加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，离心除去细胞碎片和大部分蛋白质后的上清液中加入乙醇使DNA沉淀分离。贝类或鱼实验材料：主要是利用分子筛效应。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，孔径大小决定于浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。不同分子量DNA，电泳时泳动率存在差异，形成不同的区带，泳动迁移速率与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）可与DNA分子形成EB-DNA复合物，在紫外照射下发射荧光，强度较游离状态EB大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。据此可以间接观察DNA。琼脂糖凝胶电泳的原理：四、实验步骤3.55℃水浴，消化完全后加入500μl饱和酚，颠倒混匀5min；DNA的提取2.加入50μl10%SDS和8μl蛋白酶K至终浓度100-200μg/μl；1.剪取0.1g闭壳肌或鱼的肌肉，剪碎，加入450微升抽提缓冲液；4.室温离心：12000g，10min；5.轻轻吸上清夜至另一新的离心管，加入等体积氯仿:异戊醇（24:1），颠倒混匀5min；6.重复步骤(5)；7.小心吸取上清夜至另一新的离心管，加入2倍体积无水乙醇，室温放置15min以上；8.重复步骤(5)；9.弃上清，加入70％预冷乙醇；琼脂糖凝胶电泳11.室温干燥10min，加入50-100μlTE，溶解DNA；15.凝胶成像系统扫胶和记录实验结果。10.离心：12000g，5min，弃上清;12.配制浓度0.8％的凝胶；13.取1-2微升DNA上样；14.调节电压至3~5V/cm(约150V)；五、作业本实验中所用到的下列试剂的作用是什么?氯仿，乙醇，SDSDNA是极其微小的无色无味分子，我们是如何看到的？分离高分子量的DNA时，为何不用高浓度的琼脂糖凝胶实验二水产动物RNA提取一、实验目的学习从动物组织中提取RNA原理掌握RNA提取技术和质量评价方法二、实验材料和用品冷冻高速离心机、灭菌锅、水浴锅、水平电泳系统、200度以上烘箱、匀浆器、凝胶成像系统、微波炉、紫外分光光度计等实验仪器设备：试剂：焦碳酸二乙酯(DEPC)、RNA提取试剂(Trizol)、异丙醇、氯仿、甲醛、乙醇、琼脂糖等三、实验原理RNA提取原理：RNA酶不易失活，要得到完整的RNA，必须抑制提取过程中内源性及外源性RNA酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，使RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，RNA、DNA、蛋白质和细胞碎片通过酚、氯仿等处理得到纯化、均一的总RNA贝或者鱼组织实验材料：四、实验步骤总RNA提取4.离心：4℃，12000g，10min；1.取0.2g组织加10倍体积的TRIzol，匀浆；2.室温放置5min，加0.5ml的氯仿，剧烈摇动5min；3.室温静置2-15分钟（氯仿使蛋白变性）；9.取5µl测A260、A280，取5µl电泳，其余储藏于-70℃冰箱；5.吸上清至一新离心管，加0.5倍体积异丙醇，室温静置10min以上，重复步骤4；6.弃上清，加70%乙醇(DEPC水配制)，洗涤；7.离心，4℃，12000g，5min，弃上清；8.干燥，加入50µlDEPC水；总RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳12.凝胶成像系统观察拍照。28S18SMRNA电泳图10.配制1.0%甲醛变性琼脂糖凝胶；11.在5V/cm条件下电泳30min；测比值时稀释于DEPC水使用TE溶液稀释RNA溶液问题可能原因解决方案样本裂解或匀浆不充分延长匀浆时间RNA溶解不充分65℃加热10min产量太低A260/A2801.65匀浆后未室温静置5min放置有利于RNA与蛋白的解离水相酚残留吸取上清不要搅动有机相蛋白沉淀污染吸上清不要搅动蛋白沉淀层取样后没立即抽提或冻存取样后应立即抽提和冻存样本保存不当-80℃冻存，避免反复冻融液相中RNA酶污染适当加RNA酶抑制剂RNA降解甲醛的PH值过低甲醛的PH值不要小于3.5五、作业实验中DEPC、异丙醇的作用是什么?哪些步骤最容易导致RNA降解？为什么？问题可能原因解决方案液相分离时温度高于10℃4℃离心处理，液相分离DNA污染匀浆时样本太多，抽提液太少增加TRI量样本中含有机溶剂、高离子浓度或呈碱性一、实验目的学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA实验三质粒DNA提取二、实验材料和用品恒温培养箱、摇床、离心机、灭菌锅、涡旋振荡器、琼脂糖电泳系统和水浴锅等实验仪器设备：试剂：LB液体培养基、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、饱和酚、氯仿:异戊醇（24:1）、TE缓冲液、TBE缓冲液、上样缓冲液、DNAMarker等E.coliDH5α或JM109菌株实验材料：三、实验原理DNA提取原理：当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色质DNA变性，而共价闭合环状DNA的两条链分开，外界条件恢复正常时，染色质DNA片段难复性，与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，离心后与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等被除去，而质粒DNA双链恢复原状，以溶解状态存在于液相中。四、实验步骤DNA的提取1.单菌落接种至5mlLB液体培养基，37℃振荡培养至对数生长期；2.取1.5ml，离心：4℃，12000g，30sec；3.弃上清，倒置，使液体流尽；4.菌体重悬于100μl溶液Ⅰ中，需剧烈振荡，室温下放置10min；6.加150μl预冷的溶液Ⅲ，温和振荡10sec，冰浴中5-10min，离心:4℃，12000g，5min；7.取上清，加等体积酚/氯仿(1:1)，振荡，离心：4℃，12000g，5min；8.取上清，加2倍体积的无水乙醇，混匀后-20℃20min，离心：4℃，12000g，10min；5.加入新配的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒数次，冰浴5min；9.弃上清，倒置；，70％乙醇洗沉淀一次，4℃下离心，12000g，10min；11.将沉淀溶于50μlTE缓冲液，储于-20℃冰箱中。10.去掉上清液，室温干燥；五、作业步骤5为什么温和颠倒而不能够剧烈振荡质粒DNA和染色质DNA有什么不同？试述本实验将质粒DNA从染色质DNA分离提取的原理。影响本实验结果的因素有哪些实验四DNA聚合酶链式反应(PCR)一、实验目的了解PCR反应的基本原理和基本操作技术二、实验材料和用品实验仪器设备：移液器、PCR仪、灭菌锅、制冰机、凝胶成像系统、微波炉等试剂：反应缓冲液、dNTP、MgCl2、引物、DNA聚合酶、TBE、加样缓冲液EB、琼脂糖等DNA或者质粒实验材料：三、实验原理PCR原理：1986年由KallisMullis发现。通过变性、退火和延伸，扩增位于两端已知的序列之间的DNA区段。每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增10～10倍。695’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’DNA模板第1次变性第1次退火第1次延伸5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’3’5’3’5’5’3’第2次变性第2次退火第2次延伸3’5’5’3’3’5’5’3’第n次延伸四、实验步骤1.加入PCR反应组分，具体见表（也可以加1滴石蜡油以防止蒸发）；2.置于PCR仪中，设置程序开始PCR;反应物体积/µL终浓度10xBuffer2.51xMgCl225mmol/L1.51.5mmol/LdNTP10mmol/L0.5200µmol/L上游引物5µM10.2µmol/L下游引物5µM10.2µmol/LDNA120-50ngDNATaq聚合酶0.20.5-1UddH2O17.334个循环3.电泳、观察94℃4min(预变性)94℃30secTm30sec72℃0.5-2min72℃10min五、作业PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？PCR扩增对引物有什么要求？为什么？实验五大肠杆菌感受态细胞制备一、实验目的了解感受态大肠杆菌发生的原理掌握感受态大肠杆菌化学制备技术二、实验材料和用品恒温摇床、电热恒温培养箱、台式高速离心机、超净工作台、低温冰箱、水浴锅、制冰机、分光光度计等实验仪器设备：试剂：LB固体和液体培养基、氨苄青霉素(Amp)、CaCl2溶液、甘油等E.coliDH5α或者JM109菌株实验材料：三、实验原理感受态制备原理：细菌细胞经过一些特殊方法【如电击法、或者CaCl2、RbCl、KCl等化学试剂法】处理，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。四、实验步骤受体菌的培养1.划LB平板，37℃培养过夜；挑单克隆，接种于3mlLB液体培养基，37℃振荡培养过夜；2.将该菌悬液以1:50-100比例接种于200mlLB液体培养基，37℃振荡培养至OD600=0.5感受态细胞制备(CaCl2法)3.将培养液转入离心管中，冰上放置10min，离心：4℃，3000g，10min；4.弃上清，加预冷CaCl2溶液10ml，轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后，离心：4℃，3000g，10min；5.弃上清，加10ml预冷含15%甘油的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟；6.分装成100μl的小份，-70℃保存。五、作业制备感受态细胞的原理是什么？实验六质粒转化一、实验目的学习质粒转化的基本原理和方法了解阳性克隆筛选的原理和技术二、实验材料和用品灭菌锅、移液器、水浴锅、超净工作台、离心机、恒温摇床、培养箱等实验仪器设备：试剂：LB液体培养基、LB固体培养平板等质粒和感受态大肠杆菌JM109实验材料：三、实验原理质粒转化原理：感受态的大肠杆菌细胞膜通透性暂时增加，质粒DNA在热激作用下透过细胞膜，进入细菌内，再在正常的培养条件下借助细菌的繁殖而扩增这些质粒DNA某些质粒带有大肠杆菌半乳糖苷酶基因，在该基因区外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。如果无外源DNA片段，质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色的菌落。反之如果插入外源DNA片段，将使lacZ基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。克隆蓝白筛选的原理：四、实验步骤DNA的提取1.从低温冰箱中取100μl感受态细胞悬液，冰上解