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第五章实验室生物安全的主要设备与仪器实验室生物安全的目的是减少实验室人员暴露于感染性物质的机会，避免感染性事件的发生和防止实验室废弃物对公众产生危害。熟悉并掌握实验室生物安全的主要设备与仪器的使用，可以降低实验室危险事件的发生概率。第一节生物安全柜一、生物安全柜概述生物安全柜（biologicalsafetycabinet，BSC）是为操作具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境及实验材料，使其避免暴露于操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的负压排气柜。一种箱形\空气净化\负压\安全装置工作原理主要是：将柜内空气向外抽吸，使柜内保持负压状态，通过垂直气流来保护工作人员；外界空气经高效空气过滤器（HEPA）过滤后进入安全柜内，以避免处理样品被污染；柜内的空气经过HEPA过滤后再排放到大气中，以保护环境。简单说，工作原理主要是：*送入柜内工作区的空气经HEPA过滤，保护操作人员；*安全柜内形成负压，防止气溶胶外泄，从而保护操作人员；*从柜内排出的空气经HEPA过滤后释放，保护外环境由于肉眼无法看到直径小于5μm的气溶胶以及直径为5μm～100μm的微小液滴，因此实验室工作人员通常意识不到有这样大小的颗粒在生成，并可能被吸入或交叉污染工作台面的其他材料。研究表明，正确使用生物安全柜可以有效减少由于气溶胶暴露所造成的实验室感染以及培养物交叉污染。生物安全柜同时也能保护环境和实验对象。多年以来，生物安全柜的基本设计已经历多次改进。主要改进是在排风系统增加了高效空气过滤器(HEPA)。对于直径0.3μm的颗粒，HEPA可以截留99.97%，而对于更大或更小的颗粒则可以截留99.99%。高效空气过滤器的这种特性使其能够有效地截留所有已知的传染因子，并确保从安全柜中排出的空气完全不含微生物。生物安全柜设计中的第2个改进是，将经高效空气过滤器过滤的空气输送到工作台面上，从而保护工作台面上的物品不受污染。这一特点通常被称为实验对象保护。根据结构设计、排风比例及保护对象和程度的不同，可将生物安全柜分为Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级（表5-1）。表5-1Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级生物安全柜间的差异生物安全柜正面气流速度（m/s）气流百分数（%）排风系统重新循环部分排出部分Ⅰ级a0.360100硬管Ⅱ级A1型0.38～0.517030排到房间或套管连接处外排风式Ⅱ级A2型a0.517030排到房间或套管连接处Ⅱ级B1型a0.513070硬管Ⅱ级B2型a0.510100硬管Ⅲ级aNA0100硬管Ⅱ级生物安全柜二、各级生物安全柜的工作原理（一）Ⅰ级和Ⅱ级生物安全柜的工作原理1.Ⅰ级生物安全柜的工作原理图5-1为Ⅰ级生物安全柜的模式图。操作者的双臂可以从前面的开口伸到安全柜内的工作台面上，并可以通过玻璃窗观察工作台面的情况。图5-1Ⅰ级生物安全柜模式图A前开口；B窗口；C排风；D压力排风房间空气从前面的开口处进入安全柜，经过工作台表面，经排风管排除柜外操作者的双臂可以从前面的开口伸到安全柜内的工作台面上，并可以通过玻璃窗观察工作台面的情况。安全柜内空气可通过高效空气过滤器按下方式排出：①排到实验室中，然后再通过实验室排风系统排到建筑物外面；②通过建筑物的排风系统排到建筑物外面；③直接排到建筑物外面。Ⅰ级生物安全柜是最早得到认可的，并且由于其设计简单，目前仍在世界各地广泛使用。Ⅰ级生物安全柜能够为操作人员和环境提供保护，也可用于操作放射性核素和挥发性有毒化学品。但因未灭菌的房间空气通过生物安全柜正面开口处直接吹到工作台面上，因此Ⅰ级生物安全柜对操作对象（如标本）不能提供切实可靠的保护。2.Ⅱ级生物安全柜的工作原理Ⅱ级生物安全柜在设计上不但能提供个体防护，而且能保护工作台面的物品不受房间空气的污染。Ⅱ级生物安全柜有4种不同的类型，分别为A1、A2、B1和B2型，它们不同于Ⅰ级生物安全柜之处是，只让经高效空气过滤器过滤的（无菌的）空气流过工作台面。Ⅱ级生物安全柜可用于危险度2级和3级的感染性物质的操作。在使用正压防护服的条件下，Ⅱ级生物安全柜也可用于危险度4级感染性物质的操作。（1）Ⅱ级A1型生物安全柜：如图5-2所示图5-2Ⅱ级A1型生物安全柜模式图A前开口；B窗口；C排风HEPA；D压力排风；E供风HEPA；F风机1.内置风机将房间空气（供给空气）经前面的操作面引入安全柜内并进入前面的排风格栅。2.供气先通过供风高效空气过滤器，再向下流动通过工作台面。3.空气在向下流动到距工作台面大约6～18cm处分开，其中一半会通过前面的排风格栅，而另一半则通过后面的排风格栅排出。图5-3Ⅱ级B1型生物安全柜模式图A前开口；B窗口；C排风HEPA；D供风HEPA；E负压排风；F风机；G送风图5-3Ⅱ级B1型生物安全柜模式图A前开口；B窗口；C排风HEPA；D供风HEPA；E负压排风；F风机；G送风由Ⅱ级A1型演化而来。(1)维持穿过工作台开口面的最小平均吸入口风速；(2)经HEPA过滤后的垂直气流中的绝大部分是由未污染的循环吸入气流；(3)经HEPA过滤后的大部分污染的垂直气流，通过专用风道过滤后排入大气；(4)所有被生物污染的风道和静压箱应保持负压。（二）Ⅲ级生物安全柜的工作原理Ⅲ级生物安全柜用于操作危险度4级的微生物材料，可以提供最好的个体防护。Ⅲ级生物安全柜的所有接口都是“密封的”，其送风经数个高效空气过滤器过滤，排风则经过2个高效空气过滤器。Ⅲ级生物安全柜由一个外置的专门的排风系统来控制气流，使安全柜内部始终处于负压状态。只有通过连接在安全柜上的结实的橡胶手套，手才能伸到工作台面。图5-4Ⅲ级生物安全柜(手套箱)模式图A连手套的开口；B窗口；C两个排风HEPA；D送风HEPA；E双开门高压灭菌器；F化学浸泡槽表5-2不同保护类型及生物安全柜的选择保护类型生物安全柜的选择个体防护，针对危险度1级～3级微生物Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级生物安全柜个体防护，针对危险度4级微生物，手套箱型实验室Ⅲ级生物安全柜个体防护，针对危险度4级微生物，防护服型实验室Ⅰ级、Ⅱ级生物安全柜实验对象保护Ⅱ级生物安全柜，柜内气流是层流的Ⅲ级生物安全柜少量挥发性放射性核素/化学品的防护Ⅱ级B1型生物安全柜，外排风式Ⅱ级A2型生物安全柜挥发性放射性核素/化学品的防护Ⅰ级、Ⅱ级B2型、Ⅲ级生物安全柜不同类型的Ⅱ级A型和Ⅱ级B型生物安全柜的详细介绍可参考生产商的说明手册。（四）生物安全柜的选择生物安全柜与超净工作台的区别？超净工作台的工作原理通过风机将空气吸入，通过高效过滤器过滤，形成连续的无尘无菌的超净气层流，然后以垂直或水平气流的状态送出，使操作区域持续在洁净空气的控制下。三、生物安全柜的使用（一）使用前的准备工作之前，在安全柜内放置必需材料，本次实验不用的材料（如额外的手套、培养皿或培养瓶、培养基）应放在安全柜以外。放慢手臂的进出速度，以直角进出安全柜的开口。房间内减少非实验人员的活动，以免干扰安全柜的气幕屏障。开始工作之前，应使生物安全柜的风机事先运转至少3min～5min以净化柜内空气。手臂放进安全柜内约1min后，才能进行操作。工作人员穿实验工作服，带乳胶手套保护双手。背扣式隔离衣比传统的实验服的防护效果好，手套应套在实验服衣袖外面。生物安全柜的工作台面、内壁表面、观察窗内面，应以乙醇、次氯酸钠、过氧化氢、过氧乙酸等消毒剂擦拭。所有放置于生物安全柜中的材料和容器的表面也应以70%乙醇擦拭，以免将外界环境中的可污染物带入。（二）柜内材料的放置工作台面上可放置一块塑料衬底的吸水毛巾（但不可放置于前格栅和后格栅通风口上）。这块毛巾可用于日常清洁，有液体洒出时能减少气溶胶和喷溅物的形成。工作结束后，将毛巾折叠放进生物安全柜灭菌包内进行高温高压消毒。生物安全柜内一切材料应尽量放置在远离前格栅，靠近操作台面后缘的位置；易产生气溶胶的设备（如旋转搅拌机、台式离心机）也应安置在柜内操作台面后部。实际操作应按照沿工作面由清洁区流向污染区的方向进行。（三）使用中的注意事项(1)平行摆放柜内物品，避开排风孔；(2)操作宜缓慢；(3)柜内移动物品时应尽量避免交叉污染；(4)柜内尽量不要使用明火;(5)不需要紫外灯;(6)一旦安全柜中发生危害物品溢出时，应在安全柜处于工作状态下立即进行清理；(7)定期对安全柜的性能进行检查和认证（资质人员）四、生物安全柜的操作流程1.开启生物安全柜外排风机的电源开关。2.缓慢打开操作窗口，窗口开启距离20cm或设定值，一般生物安全柜应有窗口极限报警。3.开启工作照明。4.10min后即可以开始实验操作。5.生物安全柜内的操作平面上摆放实验用品时应注意避开排风孔，以免影响排气流。6.操作完毕后要注意对柜内进行消毒清洗工作。第二节灭菌器一、定义灭菌器泛指能达到灭菌要求的一切设备，即能在一定时间内杀灭一切活的微生物（包括细菌芽胞）的设备，灭菌的保证水平为10-6（即物品经灭菌后仍然有微生物存活的概率为10-6）。现已被广泛应用于医疗、教学及科研单位。二、灭菌器的种类与原理（一）高压蒸气灭菌器1.概述高压蒸气灭菌器应用最普遍，效果可靠。根据排放冷空气的方式和程度不同，分为下排气式和预真空压力蒸气灭菌器两大类。后者的灭菌时间短，对需要灭菌的物品的损害轻微，但价贵，应用未普及。目前在国内广泛应用的为下排气式灭菌器，灭菌时间较长。2.下排气式高压蒸气灭菌器这种灭菌器利用重力置换原理，使热蒸气在灭菌器中从上而下，将冷空气由下排气孔排出，排出的冷空气全部由饱和蒸气取代，蒸气的压力增高，温度也随之增高。利用蒸气释放的潜热使物品达到灭菌的要求。这种灭菌器又分为手提式和卧式。不同物品灭菌所需压力、温度及时间见表5-3。物品种类灭菌所需时间（min）蒸气压力（kPa）表压（lbf/in2）饱和蒸气相对温度（℃）橡胶类15104.0～107.915～16121敷料类15～45104.0～137.315～20121～126器械类10104.0～137.015～20121～126器皿类15104.0～137.015～20121～126瓶装溶液类20～40104.0～137.015～20121～126表5-3灭菌所需时间、温度和压力旧制压力单位磅力每平方寸（lbf/in2），1kPa=0.145lbf/in23．预真空式高压蒸气灭菌器抽真空，使灭菌柜室内形成负压，蒸气能迅速穿透到物品内部进行灭菌。预真空压力蒸气灭菌器由于要抽真空，故不适用于液体的灭菌。灭菌时间短、效率高、节省人力、时间和能源，对需灭菌的物品损害较小等优点。缺点是设备昂贵，维修费用较高，存在小装量效应，即如果灭菌物品放的过少，灭菌效果反而较差。瓶装液体不能使用此法灭菌。4.使用高压蒸气灭菌器的注意事项（1）需要灭菌的包裹不应过大、过紧。（2）包裹放置不要太密、太挤，以免妨碍蒸气透入。（3）定期进行灭菌效果监测，化学指示卡广泛用于高压蒸气灭菌效果的常规监测，卡上的色带在一定的温度及饱和蒸气结合条件下受热变色。（4）易燃和易爆炸物品如碘仿、苯类等，禁用高压蒸气灭菌法。刀、剪等不宜用此法灭菌，以免变钝。（5）瓶装液体灭菌时，要用玻璃纸和纱布包扎瓶口，如用橡皮塞的，应插入针头排气。所盛液体为瓶体积的3/4，以免沸腾泄漏。（6）已灭菌的物品应做记号，注明有效日期，以便识别，并需与未灭菌的分开放置，以免弄错。（7）每次灭菌前，专人负责应检查安全阀的性能，使用中也应密切观察运行是否正常，以免发生意外。（8）应注意先排净灭菌器内的冷空气，即在升温到排汽且有连续水蒸气喷出10min～15min时再关闭排汽孔。（9）达到灭菌时间后，关闭电源，使压力自然下降，压力指针到“0”后，打开锅盖。（二）干热灭菌器（烤箱）1．原理干热是指相对湿度在20%以下的高热。它由空气导热，一般繁殖体在干热80℃～100℃中经1h可以被杀死，芽胞需160℃～170℃经2h方可被杀死。干热灭菌器能够对粉末状物体进行灭菌，这是其他灭菌设备所难以实现的。缺点是干热传导较慢，可有冷空气存留在烤箱内，需要较高温度和较长时间才能达到消毒的目的。此法适用于瓷器、玻璃器皿、明胶海绵、液体石蜡、各种粉剂、