2016年艾滋病抗体检测技术.

2016年艾滋病抗体检测技术培训主要内容•一、艾滋病及其病原简介•二、艾滋病检测实验室设置与职能•三、艾滋病抗体检测技术•四、抗体检测流程•五、质量控制•六、生物安全防护第一部分艾滋病及其病原简介2020/1/124定义艾滋病全名为获得性免疫缺陷综合症（AquiredImmunodeficiencySydrome,AIDS）,该病由人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus,HIV）感染而引起，导致被感染者免疫功能的部分或完全丧失，继而发生机会性感染、肿瘤等。2020/1/125HIV发现1981年美国首次报告病例（回顾87年）1983年法国的巴斯德研究所首次在男同性恋者分离出淋巴腺病综合征相关病毒（Lymphadenopathy-associated简称LAV）。1984年美国Gallo等分离出HTLV-Ⅲ（嗜人类T淋巴细胞Ⅲ型病毒）1986年国际微生物学会和病毒分类学会将HTLV-Ⅲ和LAV统称为人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus简称HIV)1986年分出HIV-2型StructureofHIVVirionParticlep24CoreAgp17Matrixp7-gagp9-gagp31integraseproteaseStructureofHIVVirionParticleOrganizationoftheHIV-1Virion（有A～E多个亚型）与一种感染灰身白脸猴的猴免疫缺陷病毒（SIV）相似。HIV-1HIV-2HumanimmunodeficiencyvirusHIV（有A～J，O1～O4多个亚型）与一种感染黑猩猩的猴免疫缺陷病毒（SIV）相似。HIV-1M组HIV-1O组HIV-2非洲中部和东部美国、欧洲、南美洲、非洲和亚洲南美洲、印度、赞比亚、中国非洲中部和东部泰国、中非、印度巴西、罗马尼亚、喀麦隆加蓬、苏联、尼日利亚、乌干达、塞内加尔、赞比亚喀麦隆、扎伊尔、中非塞浦路斯扎伊尔喀麦隆、加蓬HIV型别和亚型的分类进化与地区分布：西非、印度HIVABCDEFGHIJO1O2O3O4ABCDE艾滋病病毒感染后，可严重破坏人体的免疫系统，使人体丧失抵御各种疾病的能力，有利于各种病原体的侵入，从而导致各种严重的、难以治愈的机会性感染或肿瘤，最终导致死亡，病死率可达100％。艾滋病从感染到发病的一般过程感染分期维持时间感染标志物传染性原发感染潜伏期2-4周抗体阴性（窗口期）传染危险性高原发感染症状期1-2周传染危险性高慢性感染潜伏期2－15年(平均8-10年)抗体阳性有传染性临床发病期0－3年(平均1-2年)抗体阳性抗原阳性传染性高急性期潜伏期窗口期HIV感染以后的血清学动态Anti-P24Anti-gp41/120(anti-gp36)HIVRNAAnti-Ag感染1周2周3周4周………………….1年2年3年…………….10年………..艾滋病期Anti-Ab浓度窗口期:从机体感染HIV到产生相应抗体的这段时间叫窗口期，一般平均为1~3个月，95%以上HIV-1感染者产生抗体的时间是在感染后3个月以内，个别情况到6个月可检测。第二部分艾滋病检测实验室分级设置和职能要求2020/1/1214艾滋病检测实验室分三类：1、艾滋病参比实验室2、艾滋病检测确证实验室:包括艾滋病确证中心实验室和艾滋病确证实验室3、艾滋病检测筛查实验室:包括艾滋病筛查中心实验室、艾滋病筛查实验室和艾滋病检测点艾滋病参比实验室•设在中国疾病预防控制中心。其职能包括：•1、承担全国艾滋病检测实验室网络建设的业务技术指导和评价工作。•2、建立全国艾滋病检测质量保证及质量控制体系，组织国家级实验室能力验证和艾滋病诊断试剂临床质量评估。•3、承担艾滋病检测疑难样品的分析和确证，对有争议的检测结果进行仲裁，出具最终检测报告。•4、开展应用性研究，承担与艾滋病防治相关的病原学鉴定、现场综合防治、调研、监测、临床治疗等工作中的相关检测任务。•5、建立国家艾滋病病毒毒种库、样品库、质控品库、基因库和细胞库。•6、为艾滋病确证中心实验室开展省级实验室质量管理、省级艾滋病诊断试剂临床质量评估和自愿咨询检测等工作提供技术支持和指导。•7、组织全国艾滋病检测相关业务培训，组织制定和修改与艾滋病检测工作有关的技术规范和指南。艾滋病确证中心实验室职能（1）负责职责范围内艾滋病检测实验室网络建设的业务技术指导和评价，组织艾滋病检测实验室人员技术培训。（2）建立艾滋病检测实验室质量控制体系，组织省级实验室能力验证和艾滋病诊断试剂的临床质量评估。（3）承担省级卫生行政部门指定区域内的艾滋病病毒抗体确证、抗体筛查和其他艾滋病检测工作。（4）开展应用性研究，承担与艾滋病防治相关的病原学鉴定、现场综合防治、调研、监测、临床治疗等工作中相关的检测任务。（5）建立职责范围内的艾滋病检测样品库和质控品库。（6）收集、整理和分析艾滋病检测数据及相关资料，建立艾滋病检测实验室基本资料库和艾滋病检测资料数据库。定期向省级卫生行政部门和中国疾病预防控制中心报告艾滋病检测数据及相关资料，并配合其做好个案调查、登记等随访工作。（7）负责对开展自愿咨询检测工作的艾滋病检测实验室的技术支持和指导。艾滋病确证实验室职能（1）承担当地卫生行政部门指定的艾滋病病毒抗体确证、抗体筛查和其他艾滋病检测工作。（2）及时向艾滋病确证中心实验室报告经确证的阳性结果，并配合其做好个案调查、登记等随访工作。（3）承担当地卫生行政部门指定的艾滋病检测筛查实验室的业务技术指导、培训和评价任务。（4）定期汇总艾滋病检测资料，并上报艾滋病确证中心实验室和同级卫生行政部门。（5）协助艾滋病检测实验室开展自愿咨询检测工作，给予技术支持和指导。艾滋病筛查实验室职能(1)开展艾滋病病毒抗体的筛查试验，根据需要可开展其他艾滋病检测工作。(2)负责将艾滋病病毒抗体筛查呈阳性反应的样品送当地艾滋病筛查中心实验室或艾滋病检测确证实验室。(3)定期汇总艾滋病检测资料，并上报当地艾滋病筛查中心实验室或艾滋病检测确证实验室。(4)对自愿咨询检测工作提供技术支持。艾滋病检测点职能•（1）开展艾滋病病毒抗体的筛查试验。•（2）负责将艾滋病病毒抗体筛查呈阳性反应的样品送当地艾滋病筛查实验室或艾滋病筛查中心实验室。•（3）定期汇总艾滋病检测资料，并上报当地艾滋病筛查实验室或艾滋病筛查中心实验室。•（4）开展艾滋病自愿咨询检测工作。艾滋病检测筛查实验室的申请与验收•设立艾滋病检测实验室的机构或单位应向省级卫生行政部门提交申请书。•省级卫生行政部门组织专家组对申请材料进行审查，对符合规定、材料齐全的申请者，由省级（或市地级）艾滋病检测实验室验收专家组进行现场验收。省级卫生行政部门对通过验收者发出合格通知，同时抄送省级疾病预防控制中心，未通过验收者整改后可重新提出申请。•省级卫生行政部门在组织对采供血机构执业验收时，应选派艾滋病检测实验室验收专家组专家参加对采供血机构实验室的验收。采供血机构取得执业许可后，抄送省级疾病预防控制中心备案。•迁移艾滋病检测实验室或变更艾滋病检测实验室的类别，按本办法上述规定重新申请验收。艾滋病筛查实验室基本标准•1、人员条件•至少由3名医技人员组成，其中具有中级卫生技术职称人员至少1名。负责筛查试验的技术人员需具有2年以上从事病毒性疾病血清学检测工作经验，接受过省级以上艾滋病检测技术培训，并获得培训证书。•2、建筑条件•实验室或检测区域应分为清洁区、半污染区和污染区，应符合二级生物安全实验室（BSL-2）要求。•3、仪器设备条件•配备艾滋病病毒抗体筛查试验所需设备，至少包括酶标读数仪、洗板机、普通冰箱、水浴箱（或温箱）、离心机、加样器（仪）、消毒与污物处理设备、实验室恒温设备、安全防护用品和生物安全柜。2020/1/1222艾滋病检测点基本标准1、人员条件至少由2名经过艾滋病检测技术培训并获得培训证书的专业人员组成。2、建筑条件需有艾滋病检测区域或专用实验台，能开展简便、快速检测。3、设备条件需配备快速试验所必须的物品，包括普通冰箱、消毒与污物处理设备、一次性消耗品、安全防护用品。第三部分艾滋病实验室检测技术章节对比2004版2009版1样品的采集和处理样品的采集和处理2HIV抗体检测HIV抗体检测3HIV核酸定性检测HIV-1抗原检测4HIVRNA定量检测HIV核酸检测5CD4和CD8T淋巴细胞检测HIV-1耐药检测6HIV抗原检测CD4和CD8T淋巴细胞检测7艾滋病实验室安全防护和职业暴露预防HIV-1的分离培养8艾滋病实验室质量管理实验室生物安全9艾滋病实验室质量考评办法艾滋病检测实验室质量管理10HIV诊断试剂临床质量评估方案修改、增补和完善的内容1.在样品的采集和处理中，增加了滤纸片干血斑样品、用于CD4/CD8T淋巴细胞测定样品、尿液和唾液样品的采集和处理。2.在HIV抗体检测中，增加了免疫荧光法和化学发光法，进一步明确了不同情况下的检测策略。3.在HIV核酸检测中，增加了HIV感染产妇所生婴儿HIV感染早期诊断检测流程和适用于窗口期的集合核酸检测法。修改、增补和完善的内容4.根据临床治疗需求，增加了HIV-1耐药检测。5.进一步完善了艾滋病检测实验室安全防护和艾滋病检测实验室的质量管理，使其更加符合目前艾滋病防治工作的需求，更加具有可操作性。6.增加了HIV-1新近感染检测和HIV-1的分离培养技术。艾滋病实验抗体诊断方法（一）化学发光法第三代(国产)：双抗原夹心法免疫层析试验（硒标法）确证试验第二代：夹心法（只检测IgG）检测多种特异抗体第四代：增加检测P24抗原第三代(进口)：双抗原夹心法增加检测O亚型明胶颗粒凝集试验（PA）免疫渗滤试验（金标法等）蛋白印迹法(WB)检验目的检验方法检验标志物快速诊断试验筛查试验酶联免疫试验（ELISA）HIV(1+2)抗体艾滋病实验诊断方法（二）CD3、CD4、CD8+T淋巴细胞流式细胞仪法治疗相关CD4定量RT-PCR、bDNA、NASBA普通RT-PCR检测P24抗原定量(病毒载量)病毒核酸定性检测分子研究检验目的检验方法检验标志物酶联免疫试验早期诊断病毒抗原免疫渗滤试验（金标法）HIV抗体筛查试验一、快速诊断试验：写病人编号测试品种测试号码质控结果条带病人结果条带加样处滴50ul血清或血浆滴50ul全血滴1滴缓冲液阳性阴性无效无效3-15分钟免疫层析试验（硒标法）明胶颗粒凝集试验（PA）：PA的操作和结果判断5450/630nm下测定OD值混匀，加盖，37℃温育洗板3加入底物第二次特异性结合4加入终止液1加入样品洗板2加入酶标记物加盖，37℃温育加盖，37℃温育第一次特异性结合二、酶联免疫分析（ELISA）（第三代、双抗原夹心、两步法）可检测多种抗体化学发光法待测抗体酶标记的抗原发光底物包被抗原1.缩短窗口期：3-4天2.灰区结果减少。3.国际主要HIV检测试剂评估：无论是第四代（Abbott），还是第3代试剂（bio-rad），化学发光试剂都排第一，国产科美。时间分辨免疫荧光法第四代：可同时检测抗原及抗体•区分ELISA真阳性与假阳性，确诊出阳性样本•针对各种病毒蛋白的特异抗体•检测HIV-1和HIV-2HIV抗体确证试验WesternBlot免疫印迹法全自动免疫印迹仪各种诊断试剂特点（对缩短窗口期的效能）新发感染（包括婴儿早期诊断）、耐药性研究血液筛查、复核血液筛查、复核常规筛查应急（职业暴露）、急诊、VCT等推荐用途特异性较好敏感性不足35天5周明胶颗粒凝集试验(PA)10天15天21天25天35天不用于常规诊断1周多核酸检测结果较难判断假阳性率偏高2周多ELISA（进口第四代）较为成熟稳定性好3周ELISA（进口第三代）特异性好(与WB一致)敏感性不足5周金标法、硒标法窗口期特点诊断试剂普及批间稳定性欠佳3周多ELISA（国产第三代）快速试剂–偏远地区–用于急诊手术–用于高危行为的门诊病人–即将分娩的孕妇–HIV职业暴露者快速试验前滞现象：指反应中抗体含量过多，影响抗原抗体的理想结合，