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第一章蛋白质（酶）、核酸的分离纯化第三章层析技术第二章离心技术第四章电泳技术第一章蛋白质（酶）、核酸的分离纯化第一节引言一、分离纯化的意义二、分离纯化的要求三、分离纯化的一般程序第二节蛋白质（酶）、核酸分离纯化的前处理一、材料的选择与预处理二、细胞的破碎三、细胞器的分离四、提取第三节分离纯化一、粗提纯二、精提纯三、纯度鉴定第四节生物大分子的浓缩、干燥及保存第一节引言蛋白质（酶）、核酸存在于一切生物体中，是非常重要的生物大分子；蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能；核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指导各种蛋白质的合成。性质方法分子大小透析、超滤、差速离心、凝胶过滤溶解度等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀电荷电泳、离子交换层析吸附性质吸附层析对配体分子的生物亲和力亲和层析生物大分子的分离纯化的方法很多，主要是根据分子之间特异性的差异，如分子大小、溶解度、电荷等建立起来的。一、分离纯化的意义①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义；②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂；（如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等）③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病；④基因工程的需要。二、分离纯化的要求1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究其一级结构和空间结构的蛋白、一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失，而且提纯步骤越多，损失越大。三、分离纯化的一般程序生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段：①材料的选择和预处理；②破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）；③分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离。其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。第二节蛋白质（酶）、核酸分离纯化的前处理一、材料的选择与预处理选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理，若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。二、细胞的破碎分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失其生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。组织细胞的破碎方法很多，根据不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎；植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的；细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。三、细胞器的分离细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。四、提取组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏，这就是提取。提取实际上就是将制备物从复杂的生物体系中转移到特定的人工液相体系中（通常是水、缓冲液、稀盐溶液或有机溶剂）。1、蛋白质（酶）的提取大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）或0.1mol/LTris-HCl（pH7.5-8.0）缓冲液作提取液。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。2、核酸的提取DNA和RNA在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。DNA的提取：一般是利用DNA-核蛋白（DNP）易溶于1mol/LNaCl溶液。RNA的提取：利用RNA-核蛋白（RNP）易溶于0.14mol/LNaCl溶液，先提取得到RNP。提取得到DNP或RNP后，再将蛋白质除去即可得到相应的核酸。蛋白质的去除可以选择去污剂法或有机溶剂法。去污剂法是利用SDS等阴离子去污剂与蛋白质带正电荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液，使SDS-蛋白质复合物沉淀，并使多余的SDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。有机溶剂法是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水相，下层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。最后利用乙醇或异丙醇将核酸沉淀离心收集即可。蛋白质的去除第三节分离纯化从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两步进行。一、粗提纯1.蛋白质的粗提纯主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开。这些方法的特点是简便，处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。（1）盐析向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质中盐的浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%饱和度饱和析出析出分段盐析（2）等电点沉淀蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。（3）有机溶剂法与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个：降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。2.核酸的粗提纯从细胞中提取得到的核酸，常混杂有蛋白质及各种大小的核酸同类物等杂质，可采用适当方法进行粗提纯。粗提纯中，进一步将蛋白质除去,可用去污剂或有机溶剂多次反复提取。从RNA除去混杂的DNA，可用DNAase将DNA降解掉。从DNA中除去混杂的RNA，可用RNAase将RNA降解掉。二、精提纯1.蛋白质精提纯一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率的柱层析及电泳方法。常用的柱层析方法有凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析。常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳。另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。核酸样品进行精提纯，一般常用超离心、电泳、柱层析等方法。超离心包括速度区带离心、沉降平衡超离心。电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。前者凝胶孔径小，适合分离1000个核苷酸以下的核酸分子。后者孔径大，适合分离较大的核酸分子。柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱层析。2.核酸精提纯三、纯度鉴定生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用2-3种不同的方法才能确定。核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280）等方法。同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种方法才能确定。第四节生物大分子的浓缩、干燥及保存一、浓缩1.吸收法2.超滤法二、干燥1.真空干燥2.冷冻真空干燥三、样品的保存1.干态保存2.液态保存离心技术概论一般制备离心超离心技术第二章离心技术台式高、超速离心机0.6-10万rpm离心机制备性分析性分析性超速离心机普通离心机冰冻离心机台式（或地面式）普通离心机大容量冰冻离心机小于0.6万rpm高速冰冻离心机0.6-2.5万超速冰冻离心机2.5-8万或更高(分析性超速离心主要用于检测大分子物质的沉降特征和结构等)概述一般制备离心一般制备离心是指在分离、浓缩、提纯样品中，不必制备密度梯度的一次完成的离心操作，实验室用低、高速离心机可应用于此项技术。台式或地面式普通离心机高速冰冻离心机科研人员将采集的脐带血放置到低温超速离心机内进行技术处理③超速冰冻离心机应用范围：■病毒及亚细胞组份分离■蛋白梯度分离■脂蛋白分离■RNA梯度沉淀■质粒DNA提纯制备性超速离心主要利用离心机转子高速旋转时所产生的强大离心力，加快颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数或浮力密度差的物质分开。沉降系数指单位(cm)离心场中颗粒沉降的速度，用s表示，其单位是1×10-13秒，简称S，即1S＝1×10-13秒。沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。制备超离心的关键是如何根据颗粒和介质的性质以及转子的某些参数来确定转速和离心时间。颗粒沉降的时间和速度取决于：离心力、颗粒的大小形状和密度、沉降介质的密度和粘度。超离心技术一、原理和计算二、转子离心管及选择三、离心技术类型四、梯度回收一、原理和计算（一）离心力和相对离心力当离心机转头以一定的角速度w（弧度/秒）旋转，颗粒的旋转半径为r（厘米）时，任何颗粒均受一个向外的离心力，此离心力为：F=mω2r①式中，F通常以地心引力表示，称为相对离心力（RCF），相对离心力指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度g（980厘米/秒2），这时RCF可表示如下：RCF=ω2r/980②实际上，这一关系式常用每分钟转数n（或rpm），以更通用表达式来表示，由于ω=2πn/60于是：RCF=4π2（rpm）2r/3600*980③简化得