生物实验：酪蛋白磷酸肽制备

实验十四酪蛋白磷酸肽制备设计性实验一．原理活性肽大都以非活性状态存在于蛋白质长链中,如果用适当的酶水解,可得到活性多肽。酪蛋白磷酸肽（简称CPPs)，就是以牛乳酪蛋白为原料,经单一酶或复合酶水解分离而得到的一种含有成簇磷酸丝氨酰基的多肽。该多肽的生理活性与分子中的氨基酸组成和排列顺序有关,同时又取决于CPPs制备工艺中所使用的酶，研究表明选用胰蛋白酶单酶法水解，CPPs具有较高的生物活性。酪蛋白磷酸肽的生物活性表现为，在pH呈中性至微碱性的动物小肠下端,能与Ca+2、Fe+2和Zn+2等金属离子结合,阻止这些金属离子与磷酸根结合产生沉淀,使小肠内可溶性的钙、铁和锌的浓度增加,从而促进这些必需金属离子的吸收和利用。多肽研究现状具有生物活性的多肽，特别是短肽的发现和研究，已经成为多肽类药物和功能性食品添加剂开发和研究的热点与焦点。活性肽大多以非活性状态存在于蛋白质长链中，如果用适当的酶水解，它们的活性就被释放出来。近年来已经有很多具有生物活性的多肽通过蛋白质的消化被发现并分离出来。牛奶是大众食品，更是一种其它食品无法取代的营养品，牛乳中的酪蛋白，过去一直认为它仅仅只是营养蛋白，为生物提供氨基酸和氮源，很少注意到它是否可以经蛋白水解释放出活性肽，但目前众多的研究表明，通过不同的蛋白酶水解酪蛋白可以获得丰富的生物活性肽。这些活性肽中研究最多的是酪蛋白磷酸肽关于胰酶和胰蛋白酶分别代表两种不同酶（单酶和复酶），酶源广泛易得，价格也相对比较便宜。胰酶和胰蛋白酶提取自动物胰脏。胰酶是由胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等构成的混合酶系，来源丰富，价格低廉。其中它的重要成分胰蛋白酶和糜蛋白酶（占90%以上）起水解作用。胰蛋白酶主要通过胰酶的分离纯化得到，价格比胰酶要高，但它的专一性强，切割酪蛋白后产生的富含磷酸丝氨酸的短肽长度适中，既富集了磷酸丝氨酸基团，同时又使该肽段易于分离。其它蛋白酶则由于切割位点不适合而难以得到富含磷酸丝氨酸的肽。此外，胰蛋白酶的最适PH在中性稍偏碱性区域，而在此PH范围内，酪蛋白的溶解度也比较大，有利于反应进行。在采用胰蛋白酶水解酪蛋白时，水解PH应控制在8.5。CPP的评价指标由于CPP的功能性质（促进钙的吸收和利用）要通过体外模拟或活体动物实验才能给予评定，因此不适合作为评定指标。分子结构决定其功能性质，但多肽的测定非常复杂，因此CPP的分子结构也不可能作为评定的指标。酪蛋白分子中含有磷酸基的数目是一定的,N/P越小，则产品中不含磷酸基的肽段被切除和分离得越多，CPP的肽链就越短、产品的纯度也就越高。因此N/P值能较客观地反映CPP肽链的长短及磷酸基的密度，可作为CPP的特性指标。功能:其功能表现出抗龋齿、抗骨丢失、增强受精和胚胎发育等。是21世纪重点开发的药物和功能食品。酪蛋白——碱性蛋白酶水解体系是制备生物活性多肽——酪蛋白磷酸肽的有效酶解体系。美、日已将其作为补钙功能食品的原料，德国也将其列入药典。1.促进钙的吸收Ca在肠道中必须以离子的形式才能被吸收，在小肠前段维生素D作为Ca吸收促进剂可加强Ca在小肠前段的主动吸收。而在小肠后段Ca的吸收形式是被动扩散，吸收效率取决于小肠内Ca离子的游离浓度。Ca在小肠后段中性至弱碱性环境中易与磷酸根离子结合形成不溶性盐而降低游离Ca离子的浓度使吸收率降低，CPPs在中性或弱碱性条件下其核心部位磷酸丝氨酸集中了大量的负电荷，能与钙、铁、锌等元素的二价离子螯合形成可溶性盐，提高矿物元素的溶解性，螯合物被肠壁细胞吸收后释放出矿物元素，从而提高了矿物元素的吸收和利用率，同时还可以有效地延长矿物质在体内的滞留时间。CPPs抑制磷酸钙沉淀的机理的解释磷酸钙沉淀在刚形成时是无定形的状态，然后逐步转变为晶体并长大，CPPs能黏附在无定形物的表面，抑制其进一步的成长，肠内的钙以很高的频率和CPPs不断接触、释放，保持游离状态，在不受磷酸根的作用状态下被带到肠粘膜。CPPs与钙具有适度的结合，这样的结合强度使得CPPs分子中一个磷酸丝氨酰基可以保护30多个钙离子不被沉淀，并足以推动大量的溶解钙向肠黏膜转运，而又不至于因结合太紧密而影响钙的吸收。依赖磷酸丝氨酸簇在小肠内与其他二价离子（铁、锌、锰、铜、硒等）形成可溶性络合物，依靠被动扩散增加这些元素被机体吸收的数量。2.防止龋齿酪蛋白磷酸肽-磷酸钙溶液能凭借高钙浓度梯度促进牙釉质早期龋齿的再矿化，防止口腔细菌产生的酸对牙釉质的脱矿质作用，具有抗龋齿功能。具体原理为：CPPs磷酸丝氨酸簇结合钙后，以非晶体形式定位在牙蚀部位，磷酸丝氨酸钙盐提供自由的Ca离子和磷酸根形成的缓冲液，减少了釉质的脱矿，从而有效防止牙蚀细菌的侵蚀和造成脱矿过程。用CPPs制成的抗龋齿添加剂是目前唯一不同于氟化物的添加剂，因此，许多口腔护理产品已经应用CPPs。3.提高繁殖性能CPPs能提高精子和卵细胞的受精率。研究表明，含有CPPs培养液中的精子明显比不添加组具有更强的穿透卵细胞的能力，主要是加强了精子顶体的反应能力。CPPs还能使精子的穿透力较早地达到最大值，并保持较长时间的穿透能力，减少精子的变异程度使胚胎发育更加稳定。添加与不添加CPPs的精子穿透率分别为43.9%和20.7%，发育成胚泡的分别为13%和6%,CPPs的添加效果显著。CPPs促进体外受精作用的机理目前还不大清楚，可能与溶解状态的Ca＋2介导的精卵细胞融合有关。4.增强动物机体免疫力CPPs结构中起免疫调节作用的部位是含有3个氨基酸残基的小肽，且N端和C端分别有一个磷酸丝氨酸残基，触发淋巴细胞增殖反应。CPPs残基形成的复合物阻止了磷酸钙沉淀的产生从而促进Ca的吸收，达到促进动物免疫机能的作用。5.CPPs对动物作用CPPs为一种功能性的饲料添加剂。添加到日粮种促进动物对矿物质离子的吸收利用。在低钙日粮中CPPs可提高蛋鸡的蛋壳强度，增强机体的体质，减少腿病的发生。在种猪日粮中添加CPPs能显著提高卵细胞的受精率，提高种蓄繁殖性能。对怀孕母蓄及种用家蓄，防止营养性缺铁贫血，显著提高仔猪血清中特异性IgA、IgM、IgG的含量，从而增强仔猪的免疫力。CPPs①安全性好。制取CPPs的原料是一种天然蛋白质，且CPPs对畜禽健康毫无损害。②稳定性好。CPPs在常温下稳定性好，防止钙沉淀，商品CPPs在5℃和25℃保存两年后，其功能指标仅下降1%和3%。③成本低。CPPs在实际添加量非常小的情况下就能起到很有效的促进作用，且其加工工艺日趋完善，生产成本也将逐步降低。应用前景1.研制功能性食品。CPPs可作为营养强化剂添加到食品中制成壮骨剂或保健食品，这方面已由美国，日本，德国等国研究开发成功。如日本的Suntory公司推出具有促钙活性的铁骨饮料，壮骨制剂等；德国推出的添加了CPPs的饼干，液体饮料等。2.用于制药。如制成CPPs-Ca的复合物，用于治疗和预防佝偻病，CPPs-Zn用于防治因缺乏Zn而引起的各种畜禽疾病，CPPs-Fe的复合物，用于防治贫血等。3.添加到牙膏、漱口液或口服含片中，保护牙齿，预防龋齿。澳大利亚临床实验证明，每天咀嚼4次含CPPs的口香糖两周，几乎可补回一半因早期龋齿而丢失的矿物质。4.制成可促进动物体外受精和细胞融合的生化制剂。5.作为饲料添加剂。CPPs用于制作处于特定生理阶段动物的保健饲料，它与二价矿物质形成的络合物（CPPs-Ca，CPPs-Zn，CPPs-Fe等），提高其生物利用率降低饲料中的添加量，有利于动物生长。二．目的1．通过实验掌握酪蛋白制备技术，CPP制备方法及工艺2．熟悉酶的性质和水解原理三．材料与方法为了便于实验教学的顺利进行，学生的实验设计应根据实验室现有的实验条件进行设计，使其具有可操作性，(1)主要材料与试剂推荐考虑用以下药品及仪器：脱脂奶粉酶醋酸缓冲液NaOHCaCl2乙醇丙酮乙醚HCl恒温水浴锅离心机(2)制备酪蛋白，酪蛋白的制备方法参考重庆大学«生物化学实验»指导书，(3)用制备好的酪蛋白制取CPP，CPP的制备工艺及工艺参数由学生自己设计，学生设计重点考虑一下几个方面：底物（酪蛋白）浓度；酶的种类及用量；酶的水解温度、水解时间；CaCl2的浓度及用量等略四．操作步骤（1）酪蛋白制备称取脱脂奶粉25g置与500ml烧杯中，用40℃的水溶解至200m1，，加热到40℃，边搅拌边慢慢加入200ml预热的PH4.60的0.2mol/L醋酸缓冲液，直到pH达到4.8左右。冷却到室温，静止5分钟后用纱布过滤，并用少量水洗涤几次过滤物，抽干，悬浮于30m1乙醇中，用布氏漏斗滤去乙醇溶液，再用乙醚洗涤一次，干燥得酪蛋白纯品。（如原料是鲜奶再悬浮于30m1乙醇中。用布氏漏斗滤去乙醇溶液，再倒入乙醇乙醚混合液洗涤两次，最后用乙醚洗涤沉淀两次，抽干。将沉淀铺在表面皿上除去乙醚．干燥、称重得酪蛋白）。（2）酪蛋白磷酸肽的制备称取8g酪蛋白并溶解至45℃100ml水中，用2mol/LNaOH调至pH8.5,保持温度在45℃，加入0.2%的胰蛋白酶，45℃水解90－120分钟（水解过程始终保持溶液pH在7.7～8.5之间），终止水解后，加入1mol/LHCl，调溶液pH到4.6，静置5分钟，然后以每分4000转/分离心15分钟除去沉淀,取上清液50ml，用2mol/LNaOH调PH6.6，加入10%CaCl213ml，再加入等体积的95%乙醇,混匀4000转/分离心15分钟，将沉淀用丙酮、乙醚洗涤后挥发干燥得CPP。实验八酪蛋白磷酸肽的测定CPP是多种短肽的混合物,其中大部分肽中含有成簇的磷酸丝氨酸序列，这一序列也正是CPP的功能基团,其含量的多少与CPP功能特性直接相关，肽链较短,磷酸丝氨酸基团较多的CPP其持钙能力最强.而CPP中磷和氮含量的比值(N/P)能较客观地反映CPP链长和磷酸基的密度,可作为评价CPP产品特性的重要指标。CPPs中氮与磷的摩尔比值（N/P）小，CPPs的肽链就短，则CPPs纯度越高，促进钙的吸收和利用的作用也就越强。一．总Ｎ测定凯氏定N法本方法适用于各类食物中蛋白质的测定1．原理蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量可计算N的含量，乘以换算系数，即为蛋白质含量。酪蛋白磷酸肽的测定（指纯度），以N、P的摩尔比值来衡量，一般在0.5-0.7之间，0.5纯度较高，0.7较差。计算方法：将测得的N和P换算为同一单位，由下公式可算出比值：N/14摩尔比值＝P/312．试剂略3。仪器定氮蒸馏装置：如图所示。1—电炉；2—水蒸汽发生器(2L平底烧瓶)；3—螺旋夹；4—小玻杯及棒状玻塞；5—反应室；6—反应室外层；7—橡皮管及螺旋夹；8—冷凝管；9—蒸馏液接收瓶4．操作方法4.1样品处理：精密称取0.2~2.0g酪蛋白磷酸肽移入干燥的500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加20ml水。放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。4.2按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。4.3向接收瓶内加入10ml2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，并以10ml水洗涤小玻杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。将10ml40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通