生物技术-基因工程

1第八章基因工程2重组DNA技术34567基因工程的应用8首字母：大写：细菌属名2-3字母：小写：细菌种名如EcoR14:大写:菌株1，2…:分离到的次序第一节、工具酶一、限制酶（restrictionenzyme）：限制性内切酶1类：限制和修饰作用*2类：识别DNA内部位点、切割双链3类：同类．根据酶结构、作用及DNA结合和裂解的特性1、分类2、命名910（2）产生平末端(bluntend):3.酶的识别和切割位点:通常4-6bp,具有回文结构(palindrom)（1）产生粘性末端(stickingend)5＇-末端:EcoR1:5＇-GAATTC-3＇3＇-CTTAAG-5’3＇-末端:Pst1:5＇-CTGCAG-3＇3＇-GACGTC-5＇Sma1:5＇-CCCGGG-3＇3＇-GGGCCC-5＇115.同尾酶(isoaudamers):识别序列不同,但产生相同的粘性末端BamH1:GGATCCSau3A1:NGATCN4.同功异源酶(isochizomers):来源不同,识别和切割位点相同如:BamH1和Bst1121、DNA聚合酶大肠杆菌中第一个发现，MW109KD方向：5＇3＇还具有5‘3’及3‘5’外切酶活性.缺口平移法标记DNA时常用二修饰酶对DNA或RNA末端进行剪切、补平、连接及化学修饰的酶。13两类：禽类成骨细胞性白血病病毒逆转录酶（AMV）moloney小鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV）方向：5‘3’作用：以RNA为模板合成DNA，构建cDNA文库2、逆转录酶（reversetranscriptase）将3＇-OH与5＇-P连接形成3＇,5＇-磷酸二酯键3、T4DNA连接酶（T4DNAligase）144、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）6、TaqDNA聚合酶和其它耐热DNA聚合酶去除DNAorRNA5＇-P，制备载体时可防止载体自身连接，提高重组效率。5、末端脱氧核苷酰转移酶：末端转移酶作用：在DNA的3＇-OH上，加上dNTPPCR时15内切酶、碱性磷酸酶、连接酶的作用16*分类：克隆载体质粒入噬菌体粘性质粒M13噬菌体表达载体大肠杆菌表达载体哺乳动物表达载体第二节载体*本质：DNA携带外源DNA进入受体细胞的运载工具。17质粒载体大肠杆菌质粒载体PBR322枯草杆菌质粒载体PNC3酵母菌质粒载体农杆菌Ti质粒载体Ti噬菌体载体噬菌体载体Cos噬菌体载体病毒载体SV40病毒载体乳头瘤病毒载体18⑴分子量相对较小，在细菌中稳定存在，拷贝指数高。⑵具有遗传标记：如抗生素性基因—半乳糖酶基因（LacZ）⑶具有多个酶的单一切点。称多克隆位点（multiplecloningsites,MCS）如PBR322(人工合成)4.3Kb：含AmP(氨卞青霉素)、Tet(四环素)24个单一切点一常用的克隆载体1.质粒（plasmid）：种类很多，但作为克隆载体须具备。19PBR32220质粒的构建21质粒携带外源基因22溶菌性（Lytic）：在细菌中连续增殖直到细菌裂时，释放噬菌体。溶原性（Lysogenic）：将其DNA整入细菌中。**只有双链DNA的噬菌体才具有溶原周期。2.噬菌体：最大容量：9—23kb感染细菌的病毒根据生活周期分⑴特点①双链DNA分子（线性或环形）②两端具有12个nt单链互补粘性末端③具非必需区（中间区约1/3长度）④可在E.Coli中大量繁殖⑤可克隆15Kb左右的外源基因23噬菌体的溶原周期和溶菌周期2425插入型载体：外源DNA克隆到分子上，使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即插入失活效应。如：—半乳糖酶失活的插入型载体（蓝白筛选）编码⑵载体类型（两种）A:载体中含一个LacZ基因半乳糖苷酶X-gal(无色)X(蓝色)+gal(半乳糖)*其中X为有色基因：（4-溴-5-氯吲哚）与gal结合成无色的X-galB:在含X-gal的培养基中，在Lac操纵子诱导物IPTG（异丙硫半乳糖苷）作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，此菌落为蓝色。26C.若LacZ基因被外源DNA插入而破坏，则不能制造半乳糖苷酶，菌落为无色（白色）。27②取代型载体（又叫替换型载体）图8-4基因工程原理P258在DNA分子的中央，插入一段DNA片段：具有多克隆位点的反向重复序列当外源DNA插入时其可被置换掉作用：提高了克隆外源DNA的能力。28*由DNA的Cos区与质粒构建*环状双链DNA特点；①含质粒的抗性标记如Amp，Tet②带Cos区，可进行体外包装③一个或多个酶切位点④分子量小，容量大/筛选AP平板2、粘性质粒（Cosmid）：容量40-50kb293031（1）大肠杆菌噬菌体（2）基因组DNA全长6.5kb（单链）（3）感染后，可复制成双链DNA（RF，DNA）（4）当RF→100—200后，只有（+）链复制4种常用载体的比较P146表8—2筛选：蓝白筛选3、M13噬菌体（M13phage）3233在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。二.表达载体（expressingvector）㈠大肠杆菌表达载体除克隆载体的特性外还含有：表达系统元件启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号启动子：常用的有trp-lac启动子（ortac启动子）噬菌体Pc启动子T7噬菌体启动子34除含有原核序列：在E-Coli中的复制起始点、便于筛选的抗性基因还包括真核表达元件启动子/增强子克隆位点终止信号和加poly（A）信号㈡哺乳动物表达载体原核受体E-Coli受体系统外源基因复制、扩增场所链霉菌受体系统外源基因表达场所酵母菌受体系统真核受体动物（哺乳）细胞受体系统一般只作基因表植物/昆虫细胞受体系统达场所基因工程的受体系统351.特点：①遗传背景清楚——利于研究②繁殖快——易获得大量基因产物（20’一代）③含质粒——利于基因转移④表达非E-Coli基因，其潜力几乎是无限的—.E-Coli受体系统2.缺点：①高水平表达基因产物易沉淀、凝集、不易折叠②基因产物纯化工艺复杂③基因产物易受污染（内毒素）④基因产物对受体菌有毒害作用⑤基因产物易被水解⑥从安全角度——并不理想⑦缺乏基因产物表达后加工机制36特点：①安全性大②遗传信息和生理状况更适合于真核基因表达③基因产物外分泌遗传背景较清楚具基因表达后加工机制二.酵母菌受体系统37⑴目的基因的获得⑵载体的选择与制备⑶目的基因与载体的结合（DNA分子的体外连接）⑷重组DNA导入受体⑸重组体筛选和鉴定⑹目的基因表达⑺基因产物的分离纯化第三节重组DNA技术的基本过程七步：38—.目的基因的制备方法：1.内切酶法2.机械力降解3.化学合成4.cDNA合成5.PCR制备法6.从基因文库中提取1.限制性内切酶法（鸟枪法或散弹法）用酶降解染色体DNA（esp原核生物），将降解的DNA克隆到载体上，从而得到目的基因优点：原理简单，操作简便，具有一定的应用范围。缺点：随机性有限，盲目性大，筛选麻烦，应用范围有限（只适用于原核生物）392、机械降解法优点：随机性大缺点：所得基因片段不能直接连接，需加工修饰。用超声波震荡等机械法使DNA断裂。3.cDNA合成cDNA文库（Cdnalibrary）：将一个细胞中，所有cDNA都与载体连接成重组DNA，并列入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，称为cDNA文库。cDNA的获得：图8—5七年制P149不同细胞，不同细胞状态，得到的cDNA文库不同。404.PCR（polymerasechainreaction）3、化学合成法a.a→code→DNA→化学合成nt5.从基因文库中提取基因文库（genomiclibrary）：因限制性内切酶将基因组DNA切成片段，每一段与一个载体连接成重组DNA，并引入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，称基因文库。411.粘性末端连接5′—末端连接（易）3′—末端连接（难）二.载体的选择和制备分离纯化三.DNA分子的体外连接（外源DNA与载体连接）P与—OH形成二酯键T4连接酶：载体经酶切后，易自身环化，形成自身载体。处理方法之一：碱性磷酸酶处理5′—P422、利用人工接头（linker）连接带有限制性内切酶切点的一段人工DNA片段433、加入同聚体尾连接：TdT末端加尾的原理44454.平端连接所用ATP及T4DNA连接酶的浓度比，粘性末端连接要高些（大于2.5倍）46转化程序：感受态细胞+质粒DNA42℃、90sec不含抗生素的培养基热休克37℃涂布选择性平板37℃得到细胞的克隆30-60min（合适抗生素）10hr（使质粒扩增）四、将重组DNA导入宿主细胞1.转化（transformayion）将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞的过程。宿主：大肠杆菌感受态细胞（CompetentCell）：E-coli经Cacl2处理（0-5℃），使细胞膜通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力。47DNAE-coli转染动、植物病毒DNA动植物细胞（transfection）噬菌体颗粒E-coli感染病毒颗粒动、植物细胞2.感染（infection）：也称转导（transduction）由噬菌体或病毒介导外源DNA进入宿主细胞的过程有一个：体外包装过程48（1）遗传学方法（2）免疫学方法（3）核酸杂交法（4）PCR技术（5）酶切鉴定1.遗传学方法⑴筛选转化菌：含抗性基因的质粒，转化后，细菌在含这种抗生素的培养基中培养，未被转化的细菌即被杀死，能生长的，就是一转化的。五、重组体的筛选495051A：当M13感染空载宿主后，产生完整的LacZ产物。-半乳糖苷酶XgalX（兰色）+gal（无外源DNA）B：当M13插入了外源DNA后，其LacZ基因被破坏，不能与宿主细胞中LacZ的互补，产生LacZ产物。XgalX（兰色）（含外源DNA重组克隆）C：蓝白筛选：⑵筛选带有重组体的克隆①插入失活法（insertioninactivation）鉴别：质粒重组体和非重组体适用于：具有两个或两个以上抗生素性标记的质粒。②-互补（-complementation）M13噬菌体（插入了一段LacZ基因）宿主（删除了一段LacZ基因Lac-522．免疫学方法原理：以目的基因在受体细胞中的表达产物作为Ag，免疫动物制备Ab，通过Ag、Ab反应，将带目的基因的克隆筛选出来。方法：放免、化学方法、显色反应等。533.核酸杂交法从基因文库、cDNA文库或重组反应质粒中筛选目的基因。将含有外源DNA的细菌生长在琼脂板上将NC膜或尼龙膜覆盖平板表面NaOH处理膜32P-DNA杂交或RNAX线曝光放射自显影阳性斑点544.PCR技术5、酶切鉴定55第四节真核细胞转染一.基本方法和原理1.磷酸钙共沉淀法（Calciumphosphateco-pecipitation）外源DNA或重组质粒DNA与磷酸钙混合，形成微小颗粒，沉积在细胞表面，被宿主细胞摄取。2.电穿孔法（electroporation）外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯中，在高频电流作用下，细胞膜出现许多小孔，外源DNA进入宿主细胞。563、DEAE—葡聚糖（DEAE—Dextran）法（带正点荷）经细胞内吞作用吸入细胞短暂表达外源DNA（带负电荷）4、脂质体(liposome)介导基因导入阳离子脂质体（膜成分）DNA负电荷与细胞膜溶合外源DNA被释放到胞浆短暂表达575、显微注射法（microinjection）将外源基因通过毛细玻璃管，再显微镜下注释到受精卵的细胞核内的方法。58tk—tk—转入外源tktk+Atk—Atk+细胞死亡补救途径细胞存活6.转染细胞的筛选①tk—细胞突变株筛选转染细胞*原理：DNA合成（两条途径）（抑制剂）氨基蝶呤（A）胸苷激酶（tk）关键酶从头合成途径补救合成在tk—细胞中，若有（A）存在，则细胞死亡。在tk—细胞中，若转入外源tk基因，即使含（A），则细胞仍可通过补救途径合成DNA，细胞存活。*方法：氨基蝶呤（A）、次黄嘌呤（H）和胸苷（T