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4.1制药动物细胞4.2动物细胞的生产特征4.3动物细胞培养基制备4.4动物细胞培养技术4.5重组人红细胞生成素的生产工艺第四章动物细胞培养制药工艺I动物细胞的结构与功能I制药动物细胞的种类I生产用细胞系4.14.1制药动物细胞制药动物细胞细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系1.形态特征I细胞膜I细胞质I细胞核I没有细胞壁I亚细胞器4.1.14.1.1动物细胞的结构与功能动物细胞的结构与功能细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系22、、动物细胞培养的代谢特征动物细胞培养的代谢特征葡萄糖和谷氨酰氨：能量和合成代谢的前体。葡萄糖和谷氨酰氨：能量和合成代谢的前体。葡萄糖限制葡萄糖限制::通过增加谷氨酰氨消耗得以补偿，反之通过增加谷氨酰氨消耗得以补偿，反之亦然。亦然。葡萄糖代谢：糖酵解为主葡萄糖代谢：糖酵解为主，，生成丙酮酸和乳酸，乳酸生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。另一条途径为分泌到胞外并在培养液中积累。另一条途径为TCATCA循循环，彻底氧化产生环，彻底氧化产生COCO22和水。一小部分为戊糖磷酸途和水。一小部分为戊糖磷酸途径径，，生成生成44、、55、、77碳糖和碳糖和NADPHNADPH。。中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。葡萄糖代谢旺盛，产生大量乳酸，对细胞有毒性。葡萄糖代谢旺盛，产生大量乳酸，对细胞有毒性。细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系GlnGln代谢：脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需代谢：脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。氨基酸。GlnGln氮源，氮源，GlnGln受限，增加其他氨基酸消耗以补偿。受限，增加其他氨基酸消耗以补偿。离体动物细胞系，转氨作用是主要代谢途径。谷氨酰离体动物细胞系，转氨作用是主要代谢途径。谷氨酰胺在脱氨酶的催化下，脱氨产生氨，对细胞有毒性。胺在脱氨酶的催化下，脱氨产生氨，对细胞有毒性。谷氨酰氨与丙酮酸发生转氨作用，生成丙氨酸，进入谷氨酰氨与丙酮酸发生转氨作用，生成丙氨酸，进入培养液并积累。培养液并积累。GlnGln能量能量::GluGlu转化为转化为αα--酮戊二酸，进入酮戊二酸，进入TCATCA循环。循环。流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒废物的积累。毒废物的积累。细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系33、蛋白质糖基化与分泌表达、蛋白质糖基化与分泌表达蛋白质合成场所：粗糙内质网上的核糖体蛋白质合成场所：粗糙内质网上的核糖体糖基化场所：内质网合成各种糖类，粗糙内质糖基化场所：内质网合成各种糖类，粗糙内质网腔内和高尔基体，加工修饰。网腔内和高尔基体，加工修饰。不同细胞系糖基化特征不同，选择适宜细胞不同细胞系糖基化特征不同，选择适宜细胞系。系。对于分泌型蛋白，分泌泡与细胞膜融合，释放对于分泌型蛋白，分泌泡与细胞膜融合，释放到胞外，完成了蛋白质的分泌表达。到胞外，完成了蛋白质的分泌表达。细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系4.1.2制药动物细胞的种类目前用于制药的动物细胞有4类：原代细胞系二倍体细胞系异倍体细胞系融合的或重组的工程细胞系细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系来源：原代细胞，传代细胞。寿命：有限细胞系，无限细胞系。染色体数目：二倍体细胞系，异倍体细胞系。获得方式：工程细胞系，癌变细胞系。生长特性：贴壁依赖型，非贴壁依赖型细胞系。细胞系分类细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系概念：从动物体内直接分离得到的细胞。特点：生长分裂不旺盛，与体内细胞相似应用：药物检测实验，药理研究。生产药品：鸡胚细胞，兔或鼠肾细胞、淋巴细胞。1.原代细胞primarycell细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系概念：原代细胞转接后培养的细胞。特点：细胞分裂增殖旺盛，二倍体核型。二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆、纯化后，获得具一定特征的细胞系。。药品生产：WI－38、MRC－5、2BS等。2.传代细胞passagecell细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系概念:生长和寿命有限的细胞系。二倍体细胞系特点：多次传代培养，失去增殖能力，老化死亡。寿命：取决于细胞来源的物种和年龄、器官。人细胞最高培养次数为50－60代。胚成纤维细胞：人，50代；鸡胚，30代；小鼠，8代。3.有限细胞系Finitecellline细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系概念：生长和寿命不受限制的细胞系，能连续传代培养。连续细胞系：Continuouscellline永久性细胞系：Immortalcellline特点：细胞无限分裂,不具有接触抑制现象，不出现异常染色体。理想的药物生产细胞系.4.无限细胞系Infinitecellline细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系概念：采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行了修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。方法：正常细胞异倍体化；融合或重组。5.工程细胞系细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系概念：染色体的断裂变成异倍体，失去了正常细胞的特点，而获得了无限增殖的能力。特点：长期培养，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求较低，适于大规模工业化生产。6.转化细胞系细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系4.1.3生产用细胞系1.人源细胞系Namalwa：类淋巴母细胞，非整体，悬浮生长。英国Wellcome公司：Sendai病毒诱导，大规模生产α干扰素，批准上市。产品逐渐淘汰。细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系作为反应器用于制药：EPO，tPA作为宿主细胞用于制药：病毒性疫苗杂交瘤细胞：单克隆抗体，诊断、治疗组织再生与器官移植（个体克隆）：本身作为产品：皮肤移植，干细胞治疗药学研究应用：分子与细胞药理、毒理、代谢生命科学研究：器官发生，细胞、分子、遗传学动物细胞培养的应用细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系WI-38：WistarInstitute（WI），二倍体成纤维细胞系，寿命有限。贴壁生长，对很多病毒敏感，第一个被用于制备疫苗。MRC-5：二倍体成纤维细胞系，生长较WI-38快，对逆境有一定抗性，用于制备疫苗。1.人源细胞系细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系CHO细胞：Chinesehamsterovary，亚二倍体。多种衍生突变株。贴壁型生长，也可悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。最为普遍和成熟表达糖基化蛋白药物的细胞。药物：tPA、EPO、HBsAg、G-CSF、凝血因子Ⅷ、DNA酶I2.哺乳动物细胞系细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系BHK－21：babyhamsterkidney成纤维样细胞，非整倍体，用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。上市重组凝血因子Ⅷ。2.哺乳动物细胞系细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系杂交瘤细胞：hybridoma脾脏B细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞特点：无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生长，大量分泌和高效表达。应用：抗体药物生产。亲本鼠：小鼠，BALB/c；大鼠，Lou。2.哺乳动物细胞系细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系流感疫苗2005，Chiron'sflucellculturevaccine：Madin-DarbyCanineKidney(MDCK)cellline：Movingfromegg-basedtocell-basedinfluenzavaccineproduction3.鸡胚细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系4.昆虫细胞系Sf21：秋粘虫Spodopterafrugiperda。Sf9：从SF21中分离得到，最常用。抗机械剪切，无血清培养基的搅拌反应器中生长。TN-5B1-4：粉纹夜蛾Trichoplusiani。表达能力比Sf9高20多倍，能悬浮培养。生产抗体、试剂盒，生物学研究细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系小结小结动物细胞结构与功能：代谢场所，合成，修饰，分泌动物细胞种类：原代与传代细胞，二倍体细胞，有限与连续细胞系生产用细胞系：人源，哺乳动物源，昆虫细胞系细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系思考题思考题（1）离体动物细胞对葡萄糖和谷氨酰氨的代谢特征是什么？合成、修饰、分泌功能与制药有何关系？（2）分析原代与传代细胞，有限与连续细胞系的异同点，举例说明制药方面的应用。（3）最常用的两种药物生产哺乳动物源细胞系是什么，有什么特点？4.1制药动物细胞4.2动物细胞的生产特征4.3动物细胞培养基制备4.4动物细胞培养技术4.5重组人红细胞生成素的生产工艺第四章动物细胞培养制药工艺I对培养条件要求严格I对培养基组成要求高I天然结构与活性的药物4.24.2动物细胞的生产特征动物细胞的生产特征生产特征生产特征动物细胞制药动物细胞对周围环境十分敏感¾无细胞壁保护，细胞膜直接接触外界。¾物理化学因素:渗透压、pH、离子浓度、剪切力等耐受力很弱，容易受伤害。¾与细菌和植物细胞相比，动物细胞培养条件要求严格地多。1.对培养条件要求严格生产特征生产特征动物细胞制药11、温度、温度哺乳动物细胞最佳培养温度为哺乳动物细胞最佳培养温度为3737℃℃鸡细胞为鸡细胞为3939℃℃～～4040℃℃;;昆虫类细胞为昆虫类细胞为2525℃℃～～2828℃℃。。耐受温度范围较窄，耐受温度范围较窄，3535℃℃～～3737℃℃细胞受伤细胞受伤::3939℃℃～～4040℃℃11小时，但能恢复。小时，但能恢复。受伤严重受伤严重::4141℃℃～～4242℃℃，部分可恢复。，部分可恢复。死亡死亡::4343℃℃以上。以上。生产特征生产特征动物细胞制药22、氧气、氧气动物细胞生长必须有氧气，缺氧时不能生存。动物细胞生长必须有氧气，缺氧时不能生存。离体培养的气体：含有离体培养的气体：含有55％％COCO22和和9595％空气，其％空气，其中氧浓度为中氧浓度为2121％。％。高氧环境高氧环境::OO22浓度浓度60%60%以上，对细胞毒性较大，以上，对细胞毒性较大，抑制生长和增殖，出现染色体异常等现象。抑制生长和增殖，出现染色体异常等现象。有时充以有时充以NN22气稀释气稀释OO22浓度。浓度。生产特征生产特征动物细胞制药33、、pHpH值值低于低于6.86.8或超过或超过7.67.6会对细胞产生严重影响甚会对细胞产生严重影响甚至使细胞死亡。至使细胞死亡。机体细胞的机体细胞的pHpH范围为范围为66～～88，而且在血液和体，而且在血液和体液中，变化范围很小。液中，变化范围很小。人体人体::血液血液pHpH比较恒定，比较恒定，7.367.36～～7.447.44。。低于低于7.057.05发生酸中毒，高于发生酸中毒，高于7.457.45发生碱中毒发生碱中毒生产特征生产特征动物细胞制药44、渗透压、渗透压正常血浆渗透压为正常血浆渗透压为280280～～310310mOsmmOsm/kg/kg高渗溶液高渗溶液::高于高于310310mOsmmOsm/kg/kg低渗透压溶液低渗透压溶液::低于低于280mOsm/kg280mOsm/kg。。动物细胞对渗透压有较强的耐受性动物细胞对渗透压有较强的耐受性离体培养细胞的渗透压应控制为等渗透溶液。离体培养细胞的渗透压应控制为等渗透溶液。增减增减NaClNaCl的浓度调整渗透压，每增加的浓度调整渗透压，每增加1mg/ml1mg/mlNaClNaCl，，渗透压增加渗透压增加3232mOsmmOsm/kg/kg。。生产特征生产特征动物细胞制药动物细胞对培养基的要求高¾完全异养，容易利用、相对低分子量的营养物¾12中必需氨基酸¾8种以上维生素¾多种无机盐和微量元素¾多种附加成分：生长类、细胞因子和贴壁因子因子及激素、结合蛋白质¾能源：单糖，葡萄糖，谷氨酰氨¾氮源：氨基酸单体化合物2.对培养基组成要求高生产特征生产特征动物细胞制药完善的翻译后蛋白质修饰功能游离核糖体：合成细胞质基质内的蛋白质。与膜结合的核糖体：合成分泌性和膜整合蛋白，多数为糖蛋白。修饰：内质网加工，高尔基体加工、转运、分泌，糖链。糖基化、磷