生物技术前沿进展之二RTPCR

TaqManREAL-TIMEPCR2什么是RealTimePCR?实时监控特定核酸目标序列PCR扩增的技术Technologytomonitor,inreal-time,thePCRamplificationofspecificnucleicacidtargets3RealTimePCR是如何实现的?在PCR混合液中含有荧光物质（fluorescence）4RealTimePCR是如何实现的?随着扩增的进行,荧光信号会随着PCR产物的增加而增加PCRPCRLotsofPCRPCRproduct5RealTimePCR是如何实现的?Real-timePCR仪会纪录每个循环的荧光信号变化Cycle3FilterASample1BinN6RealTimePCR是如何实现的?最后，RealTime软件会对采集到的数据进行分析7RealTimePCR化学原理荧光信号是怎样随着PCR产物的增加而增加的呢？SYBR®GreenITaqMan®8TaqMan®化学原理(又称5’-Nuclease)9TaqMan®化学原理•TaqMan®中会使用到两段短片段序列，称为双向特异引物10TaqMan®化学原理•TaqMan®中第三段短片段序列称为探针，结合到序列中间11TaqMan®化学原理•探针标记两种染料分子报告染料Reporterdye淬灭染料Quencherdye12TaqMan®化学原理•完整的探针报告染料Reporterdye淬灭染料Quencherdye13TaqMan®化学原理•完整的探针光(激发)能量报告染料Reporter没有荧光信号14TaqMan®化学原理•如果探针断裂了……光(激发)15TaqMan®放映开始16TaqMan®化学原理•Denaturatingoftemplate（模板变性）17TaqMan®化学原理•Annealingofoligos（引物退火）18TaqMan®化学原理•Taq酶登场……19TaqMan®化学原理•找到引物序列……20TaqMan®化学原理•Extensionofprimers（序列延伸）21TaqMan®化学原理•Extensionofprimers（序列延伸）22TaqMan®化学原理•Extensionofprimers（序列延伸）23TaqMan®化学原理•Extensionofprimers（序列延伸）24TaqMan®化学原理•Extensionofprimers（序列延伸）25TaqMan®化学原理•Extensionofprimers（序列延伸）?26TaqMan®化学原理•Taq酶很特别……具有核酸外切酶活性，可以“吃掉”结合到模板上的DNA片段27TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针28TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针29TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针30TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针31TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针32TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针33TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针34TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针35TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针36TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针37TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针38TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针39TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针40TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针41TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针42TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针43TaqMan®化学原理•Taq酶开始降解探针嗝!44TaqMan®化学原理•新的序列，新的信号！45SYBR®GreenI化学原理46SYBR®GreenI化学原理47SYBR®GreenI化学原理48SYBR®GreenI化学原理•新的序列，新的信号！49SYBR®GreenI化学原理非特异结合任意双链DNA定量结果不准确可能产生非特异性PCR产物信号50SYBR®GreenI化学原理•使用Meltcurve(DissociationCurve)检查PCR反应产物的特异性TemperatureFluorescence原始图谱51SYBR®GreenI化学原理•使用Meltcurve(DissociationCurve)检查PCR反应产物的特异性TemperatureFluorescence导数图谱52RealTimePCR化学原理•每个循环之后−理论上，反应管里的目标片断数会加倍。−荧光信号相应成比例增长。53RealTimePCR化学原理TaqMan®,还是...SYBR®GreenI?•优点−更高的特异性−不会有引物二聚体干扰−支持多重荧光实验设计−实验方法易于优化•缺点−价格稍贵•优点−价格便宜−大部分基因以及少量样品均适用•缺点−特异性稍差−必须要做Meltcurves−不支持多重荧光设计−实验方法通常需要优化54RealTimePCR实际状态线形图谱Linear半对数图谱Log55RealTimePCR常用术语•Baseline基线定义背景区域:cycle-to-cycle的范围56Baseline基线的设置•通常基线起点为Cycle3…57Baseline基线的设置•通常基线终点设置在实验信号脱离噪音信号上升前58Baseline基线的设置•软件自动设置基线软件自动为您选定基线区域59Baseline基线的设置•软件自动设置基线−每个样品单独设置基线。−可以使每个样品拥有“完美”基线。−可以照顾到既有高浓度样品也有低浓度样品的实验。60RealTimePCR常用术语•Threshold阈值在扩增曲线上，可以调节的一条水平线告诉软件到哪里获得分析数据Threshold61Threshold阈值的设置•最佳位置:Xn=X0·2n成立（指数/对数扩增期）62Threshold阈值的设置•软件自动设定阈值63Threshold阈值的设置•软件自动设定阈值−对于不同的批次的实验，需要单独设置阈值因为不同批次的实验，会有不同的指数/对数扩增期64RealTimePCR常用术语•Cyclethreshold（又称Ct值）扩增曲线与阈值的焦点，对应的带小数点的循环数Thiscurvecrossesthethresholdatcycle23.165Ct值的获得•自动分析•手动分析−基线决定阈值−阈值决定Ct值66Ct值的获得•基线决定阈值−Linear图里找基线，基线对应曲线形状67Ct值的获得•阈值决定Ct值−Log图里找阈值，指数期对应阈值68AB支持3种技术应用Presence/Absence++-+AllelicDiscriminationEnd-point终点检测QuantitativePCRReal-time实时检测