生物技术实验

生物技术实验精选朱嘉明程龙球周天鸿李月琴梁旭方方玲梁宠荣马三梅徐明芳王莹编著刘大岭邓宁李任强杨维东姚冬生2006年7月生物技术实验精选目录A遗传·基因工程部分实验一果蝇饲养及遗传学研究技术实验二人类染色体基本实验技术实验三DNA的重组、克隆与鉴定实验四功能基因实验技术实验五海洋微藻特异基因的转录和表达分析B细胞工程部分实验六动物细胞培养实验七植物组织培养实验八植物多倍体诱发和鉴定实验九转基因斑马鱼实验实验十植物转基因技术C微生物工程部分实验十一正交试验法在微生物培养条件优化选择中的应用实验十二细菌mRNA的提取及其逆转录实验十三微生物生长动力学——细菌生长动力的测定实验十四食品、药品和水等的微生物检验技术D生物化学技术·酶工程部分实验十五蛋白质双向凝胶电泳实验十六人基因组DNA提取实验十七植物基因组DNA提取实验十八抗血清的制备与效价测定实验十九酶联免疫吸附技术实验二十α-地中海贫血的快速基因诊断实验二十一从植物材料中提取制备过氧化物酶实验二十二海洋微藻的实验室培养与活性成分的分离实验二十三天然甲壳素的提取和分离实验二十四家兔动脉血压与呼吸运动的调节实验二十五模拟过氧化物酶的制备、固定与应用实验二十六以枯草杆菌生产蛋白酶实验二十七包埋法、交联法对细胞、酶的固定化操作及其比较备注：红字为精选出来的内容A遗传·基因工程部分实验三DNA的重组、克隆与鉴定前言——重组质粒的构建设计基因工程又称遗传工程、DNA重组技术、分子克隆等。它是七十年代在分子生物学发展的基础上形成的新学科。所谓基因工程，就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）某一生物的遗传物质，在体外切割，拼接和重新组合，然后通过载体把重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制和表达。按人们的意愿定向创造生物新性状，使之稳定地遗传给下一代。所以基因工程具有广阔的应用前景，即能为工农业生产和工医药保健等开拓新途径，又能为生物的细胞分化，生长发育，肿瘤发生等基础研究提供有效的实验手段。近十余年来，基因工程的发展和应用，迅速地推动了生物科学的发展，目前，基因工程技术已成为生物学领域许多实验室的常用技术，它的先进性和普及性使人们感到有必要在大学的教学课程中得到反映。所以，我系已为十几届本科生、研究生开设了基因工程技术实验，选择一些最基本，最常用的技术，以使同学对基因工程有一个基本的了解，并能掌握一些基本技术。但是基因工程的实际技术和实验系统正在不断的创新，新方法、新技术不断推出，而且在有限的学时内，所能触及的技术只是基因工程中极少的一部分，但从教学角度来看，是不可能面面俱到。我们只是希望通过本实验，让同学通过基因工程中最基本的技术训练，为今后独立工作打下基础。本实验设计主要参考书为T·Maniatis的《Molecuiarclong》第三版，彭秀玲等编著的《基因工程实验技术》等。实验中所选择的方法和条件以适合于本实验室设备为首选，具体参考应用时，可作适当更改。本套实验设计过程如下：1.染色体DNA的抽提2.PCR扩增分离目的DNA片段3.载体貭粒的抽提、纯化及检测4.载体及目的DNA片段的限制性核酸内切酶酶切与连接5.重组貭粒转化大肠杆菌6．重组子的筛选、重组质粒的抽提与鉴定图3－1重组质粒构建图1.DNA的纯度和分子量的测定一、目的熟练掌握琼脂糖凝胶电泳法。利用琼脂糖凝胶电泳测DNA分子量和质粒DNA分子纯度，并熟悉各种核酸分子在琼脂糖凝胶电泳中的位置分布和某些特性。二、原理琼脂糖是一种直链多糖。它是由B—D吡喃半乳糖和3，6—脱水半乳糖以1，3—β糖苷键相连的双糖聚合物，链状琼脂糖分子之间相互以氢键交联。形成网络系统。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基因，也不会引起核酸分子的变性，而且不吸附被分离的物质，因此成为基因工程上首选的凝胶剂。当核酸分子在琼脂糖凝胶电场中时，分子上带电基团在pH8.0条件下带负电荷，在电场作用中移向正数，至使核酸分子在琼脂糖凝胶电泳中有其迁移率。迁移率与下列因素有关：1.核酸分子的大小：在相同的条件下，不同大小的核酸分子的迁移率不同，小分子的迁移率大，大分子的迁移率小。其中线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖上电泳的速度与线状双链DNA分子的分子量对数成反比（图3－1）；所以根据迁移率大小可测定DNA分子的大小。不过实际应用时，通常将待测定的DNA和已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可知该样品的分子量大小。2、迁移率与核酸构象有关,琼脂糖凝胶电泳可以鉴别分子量相同但构型不同的DNA分子。在依常规方法抽提的质粒DNA通常具有三种不同的构象:超螺旋型（SC）、线形（L）和开环型（OC）。这三种构型分子有不同的迁移率。在一般情况下,超螺旋型（SC）迁移速度最快，其次为线状（L）分子,最慢的为开环型（OC）分子。若提取到的质粒DNA样品中,还有染色体DNA或RNA,在琼脂糖凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带,由此可分析样品的纯度(图3－2)。图3－2凝胶电泳，DNA移动距离和分子量关系（缓冲液0.5×TBE,0.5ug/ml溴化乙锭电泳条件1v/cm16小时）图3－3提纯和未提纯质粒DNA电泳图3、迁移率与电泳条件有关，低电压时，线状DNA片段的迁移速度与电压成正比，当电压高时，大分子量度DNA片段的迁移速度就不再与电压成正比，所以电压一般不超过每厘米5伏。电泳液采用缓冲液，以保证较稳定的pH值。pH值的剧烈变化会影响DNA分子所带的电荷，因而影响正常的电泳速度。电泳温度一般不影响电泳，但若因电压过高，引起发热将会导致胶融解。所以可采用冷却循环系统。4、迁移率与琼脂糖浓度有关。浓度越大，迁移率越低，当样品的分子量较大时，宜用较稀的琼脂糖浓度，分子量小时，浓度可选用大些，通常可选用0.7%浓度的凝胶。此浓度下分离DNA分子的范围为0.8—10Kb。当核酸样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入在紫外线照射下能发射荧光的溴化乙锭（EB），EB就插入DNA分子中，形成荧光络合物，使其发射荧光增强几十倍，这样极其微量的DNA也可观察到。例如用肉眼观察，可检测到0.05ug—0.1ug的DNA。三、材料1、DNA样品样品A：λDNA（限制性核酸内切酶EcoRI，HindIII酶切后样品）样品B：染色体DNA+RNA样品C：质粒DNA（三种构型DNA）2、电泳缓冲液：Tris—乙酸0.04mol/LPH8.00.002mol/LEDTA3、加样缓冲液：0.25%溴酚兰40%w/v蔗糖4、溴化乙锭溶液：0.05mg/ml溴化乙锭/水5、琼脂糖6、水平式微型电泳槽；电泳仪；微量取样器，玻片等。四、实验步骤1、用胶纸带把电泳槽两端封好，以免凝胶溶液漏出，将电泳槽置于平面水平。2、选择孔径适宜的点样板（梳板）。将梳板置于距凝胶槽一端一厘米并与该端平行的位置。梳板垂直架在槽上，使梳板底部不要触到槽底部，大约相距1毫米左右。3、称取琼脂糖0.3克置三角瓶中，加入40毫升电泳缓冲液，于电炉上加热，至琼脂糖完全融化，取少量凝胶溶液沿胶带纸边缘封好，防止倒凝胶板时出现渗漏。4、在凝胶溶液中加入0.4毫升溴化乙锭溶液（EB最终浓度为0.5ug/ml）摇匀，待凝胶溶液冷却至55℃（手摸烧瓶不烫手）轻轻地倒入水平微型电泳槽内。除掉气泡，或用梳板将气泡排至凝胶边缘。5、室温下，凝胶放置30分钟，待其凝固后，拔去梳板，保持电样孔完好。除掉防渗漏的胶带纸。把制备好的装凝胶块的微型电泳槽，放入水平大电泳槽，点样孔一端应在大电泳槽电极负极一端。然后在水平大电泳槽内加入电泳缓冲液，使其液面高于凝胶1毫米左右。6、按以下混合好样品（以下为参考值，可___________视实际样品作调节）。①：2微升样品A，2微升加样缓冲液，10微升电泳缓冲液。②：2微升样品B，2微升加样缓冲液，10微升电泳缓冲液。③：2微升样品C，2微升加样缓冲液，10微升电泳缓冲液。7、在玻片上各把上述样品混合均匀，用微量取液器分别吸取样品，小心将样品注入点样孔内，记录样品的点样顺序。8、点样孔那端的电泳槽负极连接电泳仪负极，另一端连接电泳仪正极，打开电泳仪电源开关（每次打开电源开关时，应检查电压旋扭是否置于零位），调电压至5v/cm（以水平大电泳槽的两极算距离）。9、待溴酚兰带走入凝胶6厘米后，小心取出微型电泳槽，勿使凝胶滑出，置于保鲜纸上，放在紫外检测仪上，打开紫外灯，观察电泳结果，绘好DNA区带电泳图。五、结果分析指出各核酸区带及构型和质粒DNA分子量。六、问题1、低pH值的缓冲液会降低核酸迁移率，甚至分子不能移动，为什么？2、分离高分子量的DNA时，为何不用高浓度的琼脂糖凝胶。附录：λDNA经核酸限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切割后，所产生的各片段的分子量（单位Kb）。21·265·154·974·33·532·031·901·581·380·950·830·562.细菌染色体DNA的抽提一、目的熟练掌握抽提细菌DNA的一般方法二、原理要进行重组DNA实验，就离不开外源基因的纯化，而外源基因主要来源之一就要直接从生物的染色体DNA上制备，所以制备高质量的染色体DNA样品经常为基因工程实验所需要，抽提细菌染色体DNA的方法目前已有许多种，这里所介绍的两种方法：一适用于枯杆菌染色体的抽提；另一种方法则适用于大肠杆菌染色体的制备。基因工程实验所需要的基因组DNA通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA非易事，细菌基因组DNA通常是个很大的环状态DNA，而在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA，如果要抽提到大的DNA分子，就要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。另外制备的细菌染色体DNA必须是高纯度的，以满足基因工程中各种酶反应的需要，制备的样品必须没有蛋白污染，没有RNA，各种离子浓度应符合要求，这些在染色体制备时都应考虑到。大肠杆菌染色体DNA抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）破裂细胞，SDS具有的主要功能是：（1）溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；（2）解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消除染色体DNA上的蛋白质；（3）SDS能与蛋白质结合成为R1—0—SO3R2—蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它除干净。以免影响下一步RNase的作用。破细胞后RNA经RNase消化除去，蛋白质经苯酚、氯仿:异戊醇抽提除去经洒精沉淀回收DNA。枯草杆菌染色体制备与上类似，但略加修改的方法要适合教学要求。枯草杆菌是格兰氏阳性菌，所以在SDS处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁。溶菌酶是一种糖苷水解酶，它能水解菌体细胞壁的主要化学成份肽聚糖中的β—1，4糖苷键，有助于细胞壁破裂，破裂的细胞壁在SDS的作用下溶菌，同时用蛋白酶K消化蛋白质，能解离缠绕在染色体DNA上的蛋白质，然后加入一定量的醋酸钾，使蛋白质变性，通常离心除去，在这期间可加入核糖酸酶消化RNA，最后用乙醇回收DNA。此二种方法抽提的细菌染色体DNA，无RNA和蛋白质污染，可用于限制性内切酶消化，分子再克隆等。但在下一步实验前，要测定其DNA的浓度，常用测定DNA浓度的方法，是溴化乙锭电泳法；当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB会增强发射的荧光。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待样品的浓度。三、材料（一）菌株大肠杆菌C600、枯草杆菌BR151。（二）仪器电泳设备、恒温水浴锅、低速离心机、恒温振荡器、紫外检测仪。（三）器皿玻璃离心管（10毫升）、移液管（10毫升、5毫升）、微量取样器、烧杯、玻璃棒、试管、三角瓶（四）试剂（1）LB完全肉汤培养液：1%蛋白胨0.5%酵母粉0.5%NaClpH7.5。（2）BY培养液：1%