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生物技术实验技能训练课魏春红（weich@pku.edu.cn）生物技术专业是生物学领域一个新兴的本科专业，该专业的设立旨在适应生物学应用研究型人才培养的需要，以服务于我国新兴生物技术产业快速发展的需求。对于生物技术专业的学生要求受到严格的科学思维训练，掌握一定的科学研究方法，有求实创新的意识和革新精神；在生物技术研究与开发领域具有较好的综合分析素养和价值效益观念。根据这一目标，结合我院的现状，在强调内容的先进性、手段的新颖及现代化的基础上，我们已经开设了以基因工程为主的实验，在教学中我们始终重视实验技能训练及实习课对学生的作用，学生通过实验技能训练，一是掌握了方法，二是学会了对方法及其结果的分析，三是激发了学生研究兴趣，四是启发了学生的研发观念，使学生有了进一步深造的基础和发展的潜能。使我们的学生有能力适应相关的科研和科研成果的应用开发工作。一、教学内容《生物学综合实验》中的生物技术实验依学时开设了科研应用中彼此关联的三个实验，有农杆菌介导的烟草基因转化、DNA的SOUTHERN分析及外源基因在原核中的表达，这三个实验常在同一科研阿项目中用到。如获得转基因植物后，对转基因植物中目的基因及目的基因表达量进行检测时用到后两个实验，SOUTHERN分析不但可以证明目的基因是否转入植株，还可以检测目的基因在植株中的拷贝数；原核中表达目的蛋白质的纯化品用来制备抗体，用于目的蛋白在植物中表达量的初步检测。二、教学方式主要以启发式教学理念为指导，把提高学生的实验设计能力、实验操作技能、分析解决问题的能力及强化对科研兴趣贯穿在整个实验课中，从多方面、多层次使学生有机会得到锻炼，以达到我们实验课的目的。达到我们实验课目的的途径如下：1、讲课:讲课前先了解学生掌握的有关理论的知识，在此基础上结合实验流程把关键部分作为重点讲解内容，其中适当提问与学生进行互动交流，启发学生的思考，另外把实验过程中问题点传递给学生。2、分组实验:两人一小组，增加同学的操作机会，另外以10-16人大组，分组的目的是对不同实验设计和影响实验结果的不同因素进行探讨，丰富实验结果，通过全班同学的总结讨论，加深培养学生对不同方法结果的分析总结，以达到我们多方面、多层次的教学目的。3、实验内容:选择前沿的、专业代表性强的实验内容和方法，使学生通过我们实验课学习能顺利进入随后的相关研发工作。三、实验课按排每个学年的第一学期开课，一般为该学期的第一星期到第三星期，每个星期三到星期五开设一个实验。具体上课时间依院里的按排。实验一：农杆菌介导的烟草基因转化1．时间按排星期三：讲实验、清点玻璃器皿、领物品；开始配试剂；开始灭菌；接菌；培养菌液。星期四：准备培养平皿；侵染烟草；暗培养侵染叶片。星期五：准备筛选培养平皿；转移叶片；定时光照培养。表1每个小组用超净台的时间和为所在大组要准备的试剂（两人一个小组）星期四侵染烟草时间星期五转移烟草时间第一大组的小组第二大组的小组第三大组的小组第四大组的小组第五大组的小组准备的试剂用野外苗8819172533灭菌水500ml，灭菌烧杯500ml三个，洗叶子用，本小组用。9：309210182634100ml液体LB，灭菌。50或100ml小三角瓶2个，灭菌。为所在大组做培养菌农杆菌。10：301031119273550ml液体MS灭菌后给老师，为本大组用。11：301141220283612：301251321293713：301361422303814：301471523313915：30158162432402．实验原理3．实验操作（1）侵染用菌的准备（2）叶片的侵染（3）再生苗的获得3．部分实验结果烟草的组织培养和再生植株实验二、外源基因在原核中的表达1．时间按排星期三：讲实验；开始配试剂；开始灭菌；接菌；培养菌液。星期四：活化接菌；培养菌液，诱导蛋白表达，得蛋白样品。星期五：配胶；蛋白质电泳；制干胶。表2每个小组用超净台的时间和为所在大组要准备的试剂星期三接菌时间星期四活化时间星期四诱导时间第一大组的小组第二大组的小组第三大组的小组第四大组的小组第五大组的小组准备的试剂13：81219172533液体LB150ml（分两份），本大组公用。周二上午灭菌，13:00前放到超净台公用。13:158:1012:05210182634组织领回TIMID50μL，10%APS400μL，2×上样缓冲液，本大组公用。13:258:1512:1031119273510%SDS10ml，本大组公用。13:358:2012:15412202835蛋白电泳缓冲液1000ml，4个小组公用一份，领蛋白Marker。13:458:2512:20513212936固定液200ml，本大组公用（染色液有旧的）。14:558:3012:25614223037脱色液600ml，本大组公用。14:058:3512:30715233138配蛋白胶pH6.8缓冲液50ml，本大组用。14:158:4012:35816243239配蛋白胶pH8.8缓冲液50ml，本大组用。2．实验原理（1）lac操纵子的调控模型（2）GST标记融合蛋白的纯化过程3．实验操作4．实验结果表达蛋白质的电泳结果其中“1”是标准分子量蛋白质，“2”是谷胱甘肽－琼脂糖纯化后的表达的目的蛋白样品，“3”是表达目的蛋白质的E.coliDH5α菌株含质粒pGEX2－Gst-R9的总蛋白样品，“4”是E.coliDH5α菌株含质粒pGEX2－Gst的总蛋白样品。实验三、DNA的SOUTHERN分析1．时间按排星期三：讲实验、DNA的琼脂糖胶电泳、DNA转膜。星期四：烤膜、预杂交、杂交、显色。星期五：准备MS平皿、转移叶片。表3每个小组用超净台的时间和为所在大组要准备的试剂星期五转移叶片第一大组第二大组第三大组第四大组第五大组准备的试剂8：019172533TAE电泳缓冲液1000ml，可配成50×贮液9：02101826340．25NHCl:小组数×100ml，10：0311192735变性液:小组数×50ml11：0412202836中和液:小组数×50ml，灭菌12：0513212937显色液I和II:一张膜各用30ml13：0614223038显色液III:一张膜30ml14：0715233139配6×DNAloadingbuffer15：0816243240配10％SDS10ml16：0所有同学把所领物品交还老师2．实验原理3．实验操作（1）DNA的电泳（2）对胶的处理（3）DNA的转膜（4）DNA的杂交及显色3．实验结果图3：southern结果其中M：λ－DNA/HindIII标准分子量；PC：正对照，质粒pCAMBIA1301的HindIII酶切产物；NC：负对照，非转基因兰花总DNA；DP1－3和DP1－6：GUS染色阳性的转基因兰花总DNA的HindIII酶切产物；DP1－5：GUS染色阴性的转基因兰花总DNA的HindIII酶切产物