生物样品前处理、制备、分离

1生物样品前处理、制备、分离及保存器材中国刑警学院法医系21.概述1.1生物样品处理制备的主要特点：⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。⑵许多生物样品在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。⑶许多生物样品一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物样品提取制备最困难之处。⑷生物样品的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。31.2生物样品的处理制备通常可按以下步骤进行：①确定要制备的生物样品的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。②建立相应的可靠的分析测定方法，这是进行生物样品制备的关键。③通过文献调研和预备性实验，掌握生物样品及产物的物理化学性质。④生物材料的破碎和预处理。⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。⑥产物的浓缩，干燥和保存。42.生物大分子制备的前处理2.1生物材料的选择（1）制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。（2）选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。（3）动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。（4）植物要先去壳、除脂。（5）微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。（6）生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。52.2细胞的破碎不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。2.2.1细胞破碎方法(1)机械法1)研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。2)组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。6(2)物理法1)反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。2)超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。多用于微生物材料，处理时间有数分钟到数十分钟不等，破碎细菌和酵母菌时，时间要长一些。3)压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。4)冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。7(3)化学与生物化学方法1)自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。2)溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。3)酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。4)有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。82.2.2细胞破碎相关的器械与器材1)电动组织捣碎机9电动组织捣碎机原理：用可调速电机驱动捣碎转子（头）在高速旋转下将组织打碎达到匀浆目的。市售仪器多数是可调速机型，有不同口径、头端式样的转子供选择，平头转子适于制备乳浊液及悬浮液，锯齿状转子适于制备组织和含纤维物质的匀浆。10电动组织捣碎机应用：一般用于动物组织，植物肉质种子，柔嫩的叶、芽等材料。国产的捣碎机最高转速可达1-2万转/分，因旋转刀刃的机械切力很大，制备较大分子样品很少使用。动、植物细胞30-45秒完全破碎，酵母菌和细菌需加入石英砂加强效果。112）超声波细胞破碎机12超声波细胞破碎机原理：仪器发出一定频率的超声波产生振动力破碎细胞壁和细胞器。由超声波发生器和超声换能器两部分构成。相应超声换能器的长度及尖端口径也可挑选不同长短、粗细，以满足0.1~250ml的容量需要。13超声波细胞破碎机应用：用于各种动植物细胞、病毒细胞、细菌及组织的破碎，也可用于各类高分子物质的破碎，同时可用来乳化、分离、匀化、提取、消泡清洗及加速化学反应等。14超声波细胞破碎机使用注意事项：1.长时间运转将产生过热，注意降温，可采用间歇处理方法（10-30秒）和冷却夹套选件。2.仪器发出的超声波是在液体中传递能量的，所以要保持超声换能器在液体中方能开机，避免在非液体环境中空转。3.使用后，须用蒸馏水冲洗净换能器头端。4.可能损伤细胞器，尤其是真核细胞的细胞器。153）加压细胞破碎机原理：利用高压使细胞悬液通过一个小孔（小于细胞直径的孔径）致使细胞被挤破、压碎，特别适用于厚壁细胞、细菌和较浓样品的破碎，具有快速、方便、无噪声的特点。主要技术参数电压：380V最大破碎压力：300Mpa163.过滤及超滤装置3.1过滤原理：利用多孔介质阻留固体或大于多孔介质孔径的分子而让液体通过，使固体和液体分离的方法。目的：1）去除不溶性杂质得到所需要的清液以供进一步实验。2）收集固体中间产物或结晶成品。173.1.1过滤所需器材：滤膜（滤纸）、漏斗、滤瓶，加压、减压过滤需外配气泵、蠕动泵、真空泵，并不涉及复杂的器具。183.1.2影响滤过的因素1.液体的粘滞度：粘滞度大，则滤速慢；粘滞度随温度升高而降低，故升温可加快过滤速度。2.滤膜的材料、材质：如滤纸、滤布、玻璃纤维、石棉板、多孔陶瓷滤板等，其毛细管越长，管径越小或数目越少，则过滤速度越慢。3.压差：压差越大，过滤速度越快。4.滤渣：滤渣越厚，过滤速度越慢。5.过滤液性状：过滤液中有沉淀、胶状物或其它可压缩的物质，均能造成滤膜孔堵塞，减慢过滤速度。193.1.3提高过滤速度的常用方法1.选择适当的过滤介质应考虑：①孔径大小应适于截流被分离的固体颗粒，孔径过大，则滤液不清，过小则滤速慢。②孔的数目多，孔道短且直，则滤速快，否则滤速慢。③耐酸碱，化学稳定性好。④有一定机械强度，易于回收。⑤使用寿命长，成本低。过滤介质的材质：①棉、麻、丝织品；②玻璃纤维、垂熔玻璃、石棉或烧瓷滤板、涤纶等；③滤纸（工业用和分析用，慢速、中速、快速），实验室里最常用。202.加助滤剂。如硅藻土、活性炭、细砂等。3.增加过滤推动力。常压、加压、减压。加压和减压过滤在过滤介质的下面都必须有支持滤板，如强度较大的烧瓷滤板等。4.提高过滤时的温度。以减少溶液粘度，增大溶质的溶解度，但不适于热敏物质。5.离心过滤法，利用离心力促使滤液通过过滤介质，适于分离小量组织样品。213.2超滤超过滤即超滤，自20年代问世后，直至60年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。22超滤原理：超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。23超滤技术优点：操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。应用：在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到10～50％的浓度。24超滤技术的关键是膜常用的膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH1～14都是稳定的，且能在90℃下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，能连续用1～2年。超滤膜的基本性能指标：水通量（cm3/(cm2·h)）；截留率（以百分率％表示）；化学物理稳定性（包括机械强度）等。25超滤技术超滤装置由若干超滤组件构成。分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。常用有真空透析超滤、离心浓缩超滤、加压搅拌室超滤、切向流系统超滤。263.2超滤装置本装置由蠕动泵、超滤器、压力表、调压阀及相应管路等组成。1、试样2、蠕动泵3、超滤器4、超滤液5、调压阀6、隔膜压力表274.透析4.1透析自ThomasGraham1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。透析只需要使用专用的半透膜即可完成。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。截留分子量MWCO通常为1万左右。28透析透析：膜分离技术的一种，仅让小分子扩散性的选择性的通过透过膜，把小分子从溶液中分离出去而保留生物大分子的技术。应用：常用于改换大分子溶液的盐成分，除去小分子，改变溶剂成分等。294.2透析用器材透析用器材仅涉及透析膜：常用有动物膜、羊皮纸、火棉胶、玻璃纸以及最近使用的赛璐玢膜都是用纤维或纤维素衍生物制成的。透析膜的特点：1.在溶剂中能膨胀形成分子筛状多孔膜，只允许小分子溶质和溶剂通过，而阻止大分子通过。2.具有化学惰性，不具有能与溶质起作用的基团，在水、盐溶液、稀碱或稀酸中不溶解。3.有一定的机械强度和良好的再生性。30透析膜的处理：1.从成卷的透析膜中剪下适用的长度（一般20-30厘米）。2.用过量的10mmol/L碳酸氢钠湿润透析膜并煮沸几分钟。3.在10mmol/LNa2EDTA中煮沸几分钟，重复一次。也可在稍加搅拌下浸泡30分钟替代煮沸。4.用蒸馏水或超纯水清洗数次。5.置20%-50%乙醇溶液中，储存于4℃，以防能分解纤维素的微生物生长。31注意事項：*操作时必需戴手套*1.取出透析袋要先用蒸餾水清洗乾淨，綁透析袋前要先試裝蒸餾水，看透析袋有沒有蛀孔，會不會有水噴出。綁透析袋不要太用力拉扯，否則透析袋可能會裂。2.一般透析至少要3h，至少要換兩次透析液(100至1000倍樣本體積)才能完全。3.注意離心濃縮管的離心轉速不能太快，否則薄膜很容易破裂。4.每次離心濃縮後，暫時不要丟掉外濾液(filtrate)，收集起來以防薄膜破裂流失。325.生物样品的浓缩概念：从低浓度的溶液中除去水或溶剂使之变为高浓度溶液的过程。生物样品的制备，提取后往往先要进行浓缩，然后再进行干燥和结晶。方法：1.利用亲水凝胶吸收溶液中的水分而得到浓溶液。2.超滤法利用半透膜截流大分子，适于浓缩生物大分子。3.离子交换法与吸附法是稀溶液通过离子交换柱或吸附柱，溶质被吸附后，再用少量液体洗脱、分部收集能使所需要物质的浓度提高几倍以至几十倍。4.还有冷冻融化、加沉淀剂、溶剂萃取、亲和层析等方法也能达到浓缩的目的。我们只介绍蒸发浓缩。335.1蒸发概念：溶液表面的水和溶剂分子获得的动能超过溶液内分子间的吸引力以后，脱离液面进入空间的过程。常用方法：1.常压蒸发2.减压蒸发345.1.1常压蒸发及常压蒸发装置原理：在常压下