生物活性大分子的理性设计和高效制备Version for print

江南大学工业生物技术教育部重点实验室TheKeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MOE生物活性大分子的理性设计和高效制备汇报人:王正祥报告内容•研究背景•研究内容•主要研究成果•致谢研究背景一级结构与空间结构一级结构与生物活性基因(DNA序列)mRNA蛋白质（氨基酸序列）功能我们感兴趣的分子工业用酶、重组多肽药物科学和技术问题蛋白分子特性与一级结构间精确关系创建新分子酶分子合成与分泌与其宿主细胞自身生理、生化活动的和谐平衡高效、低成本、大规模制备和工业应用主要研究内容原始来源:生物资源和信息分子特性:分子信息及其分析技术实验创建:新型生物活性分子组建技术高效制备:新型外源基因表达系统研究结果搭建了工业微生物资源和信息共享数据库和相应的网站工业微生物菌种库典型工业微生物非典型工业微生物潜在工业微生物分类和鉴定遗传和分子生物学特征育种常用生物材料生物安全性产物性状工业微生物资源数据库简要描述局域网教育部科技基础条件平台客户服务发酵微生物菌种库食品微生物菌种库极端微生物菌种库其他微生物菌种库克隆载体和表达系统工业微生物资源库工业微生物实验技术工业微生物资源和研究词汇工业微生物资源和信息组成模式图江南大学工业生物技术教育部重点实验室TheKeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MOE生物信息学分析方法、数据库的建立与应用•数据集:脯氨酸肽键，二硫键空间结构以及α-淀粉酶、木聚糖酶和耐热酶的序列、结构数据集。•方法学:基于神经网络、支持向量机和隐马尔可夫模型预测脯氨酸肽链构象；基于氨基酸和二肽含量的二元线性分类器预测蛋白质半胱氨酸氧化还原状态。•应用:肽链中脯氨酸特征,二硫键结构特征,α-淀粉酶性能与结构关系,木聚糖酶性能与序列、结构的关系以及分子进化,嗜热菌耐热性与蛋白质序列、结构和功能关系。•Cooperativityoftheoxidizationofcysteinesinproteins.Bioinformatics.Inpress.•Theinfluenceofdipeptidecompositiononproteinthermostability.FEBSLett2004,569:284~288.•AnovelmethodofanalyzingprolinesynonymouscodonsinEscherichiacoli.FEBSLett2004,576(3):336~338.•ComputationalanalysisofresponsibledipeptidesforoptimumpHinG/11xylanase.BiochemBiophysResCommun2004,321(2):391~396.•PrinciplecomponentanalysisinF/10andG/11xylanas.BiochemBiophysResCommun2004,322(1):277~280.•Predictionofthedisulfidebondingstateofcysteinesinproteinsbasedondipeptidecomposition.BiochemBiophysResCommun,2004,318,1:142~147.•RelateddipeptideandcharacteristicdipeptideofoptimalpHinα-amylase.BiochemBiophysResCommun2002,299(4):647~651.•Supportvectormachinesforpredictionofpeptidylprolylcis/transisomerization.JPeptRes2004,63:23~28.•Cooperativityoftheoxidizationofcysteinesinglobularproteins.JTheorBiol2004,231(1):85~95.•AnovelmodeltocalculatedipeptidesresponsibleforoptimumtemperatureinF/10xylanase.ProcessBiochem2005,40:1389~1394.构建了系列新型基因克隆和表达载体pBL-WZX4264bpSamyLKmR3'amyL'ApRTartPamyLAvaI(295)ClaI(4191)EcoRI(284)SmaI(297)XmaI(295)SalI(1714)NcoI(303)NcoI(1178)ApaLI(2091)ApaLI(2589)ApaLI(3835)PstI(265)PstI(799)PstI(3413)pHY-WZX6702bpTetRApRori-pAMalpha1KanRApaLI(5237)AvaI(296)BamHI(3)ClaI(2871)EcoRI(285)SmaI(298)XmaI(296)EcoRV(2709)BglII(583)BglII(1864)XbaI(281)XbaI(1453)PstI(266)PstI(800)PstI(5667)NcoI(304)NcoI(1179)NcoI(2859)NcoI(4416)pHY-p435165bpTetRApRori-pAMalpha1Pp43ApaLI(3700)AvaI(328)BamHI(323)ClaI(1334)EcoRI(333)HindIII(2)SmaI(330)XmaI(328)SalI(317)BglII(307)EcoRV(1172)NcoI(1322)NcoI(2879)PstI(315)PstI(4130)pHY-sacB7028bpTetRApRori-pAMalpha1KanRSsacBPsacBApaLI(5563)AvaI(622)BamHI(3)ClaI(3197)EcoRI(611)SmaI(624)XmaI(622)PstI(1126)PstI(5993)NcoI(630)NcoI(1505)NcoI(3185)NcoI(4742)pHY-sacB-secQ7650bpTetR'ApRori-pAMalpha1KanRSsacBPsacBsecQp43TetR'ApaLI(6185)AvaI(622)BamHI(3)ClaI(3819)EcoRI(611)SmaI(624)XmaI(622)PstI(1126)PstI(6615)NcoI(630)NcoI(1505)NcoI(3807)NcoI(5364)pSacB-p43Q17650bpTetRApRori-pAMalpha1KanRSsacBPsacBp43QamyL'ApaLI(6185)AvaI(622)BamHI(3)ClaI(3819)EcoRI(611)SmaI(624)XmaI(622)PstI(1126)PstI(6615)BglII(909)BglII(2812)NcoI(630)NcoI(1505)NcoI(3807)NcoI(5364)实践了新型生物活性分子组建方略寡核苷酸池基因库表达和筛选基因家族收集和整理计算机辅助设计引物介导基因合成和突变二维或多维筛选nbc基因产物的生化和活性特征评价Block、Domain、CAI、tRNApool计算、分析、比对受体菌遗传背景分析建立了工业生物技术共性共享平台代表性成果1:高温酸性a-淀粉酶淀粉结构与酶促水解淀粉生物加工和生物转化获得的重要工业产品淀粉环糊精a-Amylase糊精麦芽糖麦芽三糖葡萄糖麦芽糖高麦芽糖浆高果糖浆高葡糖浆结晶葡萄糖发酵基质CGTaseFungala-AmylaseGlucoamylasePullulanaseGlucoseisomerase醇类：乙醇……有机酸：乳酸……发酵剂：酵母细胞……氨基酸：谷氨酸…………1000万吨燃料乙醇需a-淀粉酶2万吨，约合￥4亿脱皮脱胚拌料蒸煮同步糖化和浓醪发酵酵母繁殖酒精高效分离固液分离脱水燃料酒精回用80％α-淀粉酶玉米原料新型酒精酵母糖化酶粉碎玉米油滤液DDG(S)20％高温、低pH环境和易染菌耐高温；低作用pH值理想的α-淀粉酶：pH4.5-6.5,105℃半衰期≥10min理想的糖化酶：最适作用温度≥80℃理想的α-淀粉酶酶学性质新型高温酸性a-淀粉酶研制过程寡核苷酸池基因库表达和筛选基因克隆和测序，同家族基因收集和整理计算机辅助设计引物介导基因合成和突变以pH和温度为参数amyNew基因产物的生化和活性特征评价Block、Domain、CAI、tRNApool计算、分析、比对地衣芽孢杆菌遗传背景分析新型高温酸性a-淀粉酶的主要酶学性质Profileofactivityversustemperature(C)020406080100405060708090100TRelativeactivity(%)Thermostabilityofrecombinanta-amylase02040608010001234t(h)Relativeactivity(%)ProfileofactivityversuspH0204060801003.54.55.56.57.5pHvalueRelativeactivity(%)主要酶学特征：1、最适作用pH（95oC）：4.8-6.2;2、有效pH范围（95oC）：4.5-7.0;3、最适作用温度：98oC;4、有效作用温度：65-100oC;5、热稳定性(105℃):半衰期30min90oC95oC100oC121oC130oC江南大学工业生物技术教育部重点实验室TheKeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MOE•Novo公司的高温a-淀粉酶：最适pH5.6-6.5,有效pH5.3-6.8,最适温度95℃,耐热性(T1/2)100℃，20min。新型α-淀粉酶的酶学性质优于现有产品重组酶的高效制备——基于优化的基因分子、优化的载体-宿主系统和优化的发酵工艺发明专利：•一种编码新型高温酸性a-淀粉酶的基因及其合成、克隆和表达。专利申请号：200510081647.2•在大肠杆菌或芽孢杆菌中分泌表达外源基因的表达载体及其构建。专利申请号：200510081648.7重组菌产酶水平显著高于国内现有水平•国内企业生产的高温α-淀粉酶：最适pH6.0-7.0,有效pH5.5-7.5,最适温度95℃,耐热性(T1/2)100℃,1min。发酵水平7000U/mL。•重组菌在15L发酵罐中的产酶水平≥10000U/mL代表性成果2:长效人b-干扰素活力半衰期延长了12倍发明专利：1.重组人干扰素α2b和人白蛋白融合共表达。专利申请号：200410065382.22.重组人β干扰素和人白蛋白融合共表达。专利申请号：200510038865.8成果、专利、著作、论文工业微生物资源和信息共享数据库部省级成果奖：2项国家发明专利：公开1项，申报6项著作：2部论文：62篇，其中，SCI引用论文13篇未来工作重点基质平台：生物质高效水解酶系（高、中、低温／酸、中、碱性）a-淀粉酶，生淀粉酶，（高、中温）糖化酶，（高、中温）普鲁兰酶高温纤维素酶，高温b-葡聚糖内切酶，高温b-甘露聚糖酶，等重组多肽药物：8种长效多肽药物G-CSF、rHuIFN-β1α、甲状旁腺激素、利尿钠肽、人生长激素、胰岛素、IL-1拮抗剂、IL-11致谢国家高技术发展计划教育部科技基础条件平台建设计划教育部新世纪优秀人才支持计划教育部优秀青年教师基金江苏省青蓝工程江阴星达生化工程有限公司DAADSpecialPrograminBiosciencesBMBFGenoMikNetzworkGoettingen,Deutschland谢谢各位专家！