生物物理学报第二十四卷第四期二八年八月

生物物理学报第二十四卷第四期二八年八月ACTABIOPHYSICASINICAVol.24No.4Aug.2008收稿日期:2008-05-30基金项目：NIH/NCRR/RCMI2G12RR003048,USAMRMCW81XWH-05-1-0291,andNIH5U54CA091431通讯作者：王秩秋，E-mail：[e-mail];引言核磁共振成像因其具有无创、快速、高解析率、高对比度等特点，在临床上广为使用。特别是在肿瘤的诊断中，该技术利用病变组织和正常组织物理特性的不同而获得的结构、功能影像，已经成为原发肿瘤和肿瘤转移早期诊断中不可或缺的重要依据[1]。肿瘤的形成是长时间、多因素控制、多步骤、多基因突变的复杂变化过程。大多数恶性肿瘤都是单克隆起源，呈现无控制性生长。在临床上，相当一部分患者寻求医治时，疾病已经进入中、晚期，丧失了最佳的治疗时间，这是肿瘤死亡率居高不下的原因之一。核磁共振成像虽然具备上述种种优点，但因其较低的灵敏度却不能满足肿瘤早期诊断的要求。这是因为，早期肿瘤和正常组织在物理特性上差异较小（例如T1和T2），这种微小的物理特性差异不足以产生肿瘤和正常组织的影像对比[2~4]。为了解决这一难题，人们应用核磁共振造影剂来增强肿瘤和正常组织影像的对比度以利于肿瘤的早期诊断。然而，现有的造影剂(如：Gd-DTPA)主要是经呈高渗透状态的肿瘤血管，被动扩散到肿瘤组织的细胞间质，这种非特异造影剂难以达到另人满意的对比成像效果，在使用中受到一定限制。随着靶向药物的不断发展，科学家希望通过特异性生物分子介导，合成出一类具有肿瘤靶向性的造影剂，以进一步降低核磁共振成像技术的检测极极限，用于肿瘤的早期诊断[5~7]。肿瘤靶向造影剂主要由配体﹑造影剂载体和造影剂三部分构成。从理论上讲，由于肿瘤表面抗原过度表达，肿瘤靶向造影剂可以特异性地聚集在肿瘤细胞表面，从而增强微小肿瘤病灶的核磁信号，实现肿瘤早期诊断。文献报道，纳米尺度的阳离子脂质体(Lip)可被用作药物或基因治疗的载体[8]。在脂质体的表面修饰上如叶酸﹑转铁蛋白(Tf)或抗肿瘤表面抗原抗体转铁蛋白导向脂质体核磁造影剂纳米粒子（TfNIR鄄LipNBD鄄Magnevist）———一种肿瘤靶向磁共振造影剂王秩秋1，单良1，王颂平1，AlexandruKorotcov1，梁兴杰1,2（1.MolecularImagingLaboratory,DepartmentofRadiology,HowardUniversity,WashingtonDC；2.中国国家纳米科学中心，北京100080）摘要：造影剂辅助的核磁共振成像是目前肿瘤诊断的最好方法之一。但是由于核磁共振成像内在的低灵敏性以及造影剂的非特异性，导致肿瘤早期诊断较为困难。文章将一种新的肿瘤靶向核磁造影剂纳米粒子应用于早期肿瘤的影像诊断。这种新的肿瘤靶向核磁造影剂纳米粒子由配体转铁蛋白(Tf)、纳米水平的正电脂质体(Lip)载体和临床常用的造影剂Magnevist(TfNIR-LipNBD-Magnevist)三部分构成。另外转铁蛋白和脂质体粒子上，亦标记了荧光物质用于确定转铁蛋白-脂质体-造影剂纳米粒子的靶向性，以及肿瘤的光学影像诊断。在体外实验中，利用激光共聚焦显微镜和光学影像证明了靶向纳米粒子介导的细胞内吞和特异性结合。在裸鼠肿瘤模型中，造影剂纳米粒子TfNIR-LipNBD-Magnevist经尾静脉注入后，显著增强了肿瘤内信号与周围组织的对比度。由造影剂纳米粒子介导的肿瘤内信号显著强于单独Magnevist辅助的肿瘤内信号。同时，利用光学影像方法，在肿瘤内检测到特异的荧光信号。其结果进一步支持了转铁蛋白-脂质体-造影剂(TfNIR-LipNBD-Magnevist)纳米粒子的靶向性和肿瘤影像诊断的有效性。关键词：核磁共振；肿瘤诊断；转铁蛋白；纳米粒子；靶向性；光学成像中图分类号：Q6-332008年生物物理学报等靶向配体，就可以特异性引导造影剂到达癌细胞。用于肿瘤靶向的靶向基团一般需要具有体积小、毒性低、对肿瘤特异性结合能力强、无免疫原性等特性。肿瘤靶向脂质体粒子不但能选择性地运载药物或基因到癌细胞，而且更增加了脂质体的转染效率。转铁蛋白受体在许多肿瘤，包括口腔、前列腺、乳腺、胰腺等癌细胞表面呈现高表达[9~14]。比如，有研究表明在74%的乳腺癌、76%的肺腺癌、93%的肺鳞癌中转铁蛋白受体呈现高表达。且转铁蛋白受体的表达水平与肿瘤的增长速度及预后成正比[14]。因此，近年来基于转铁蛋白的肿瘤靶向药物研发十分活跃，转铁蛋白、转铁蛋白受体的抗体、或单链抗体片段等被用来作靶向的基团[15]。本文利用阳性脂质体粒子、转铁蛋白和临床上使用的核磁造影剂Magnevist构建了转铁蛋白-脂质体-Magnevist肿瘤靶向纳米粒子（TfNIR-LipNBD-Magnevist），来增强核磁共振影像的对比度，用于肿瘤的早期诊断。为了研究方便，我们还在转铁蛋白上标记了近红外荧光物质。在实验中，采用光学成像的方法，确定转铁蛋白-脂质体-造影剂纳米粒子的生物分布。光学成像方法简易，检测灵敏度高（可达10原9~10原12mol/L），没有放射性，因此在动物模型观察基因表达、基因传递，以及手术中确定肿瘤的边界上已有很好的应用[16~18]。光学影像受限制于荧光在体内有限的穿透力，目前仅能提供较好的二维空间的影像。如果核磁共振高解析度成像和高灵敏度的光学成像相组合，可在分子水平上显示某疾病特殊丰富的影像表位[19~21]。一系列实验表明，通过转铁蛋白介导的靶向型核磁造影剂纳米粒子，特异性地富集于肿瘤组织，显著增强了核磁共振影像的对比度[22,23]。1材料与方法1.1双重标记靶向纳米核磁造影剂TfNIR鄄LipNBD鄄Magnevist的制备阳离子脂质体1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine(DOPE)和1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane(DOTAP)按1∶1的比例(重量)混合溶解在氯仿溶液中(Lip)，或在DOTAP:DOPE中再加入0.1%NBD-DOPE〔荧光标记脂质体DOPE-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)(AvantiPolarLipids,Alabaster,AL)〕构建带有NBD荧光标记的脂质体(LipNBD)。取3.6滋l(精确度只能到0.1滋l)LipNBD混合液经氮气吹干后加入50滋l含12滋lMagnevist造影剂(Berlex,Wayne,NJ)的水溶液重新水化LipNBD。每微升Magnevist造影剂含469.01滋ggadopentatatedimeglumine。震荡10分钟后用水调至175滋l。将此混合液先用超声降解(80-90W,10min)，然后分别经孔径为0.2滋m和0.1滋m的聚碳酸脂薄膜过滤。最后加入25滋l荧光剂Alexa680标记的人转铁蛋白(TfNIR,5mg/mL)(Invitrogen,Carlsbad,CA)，混匀后静置10分钟以上。所有实验都用新鲜制备的探针。最终反应物的体积为200滋l。脂质体、人转铁蛋白与Magnevist的比例为10∶12.5∶0.56(nmol/滋g/mg)。另外，为研究探针的细胞内吞作用，用近红外Alexa680荧光剂替代核磁共振造影剂构建了Tf-LipNBD-dye探针。浓度为200滋l探针内含2滋lAlexa680荧光剂。1.2细胞培养和动物模型我们用人乳腺癌MDA-MB-231-luc(CaliperLifeSciences,Hopkinton,MA)培养细胞和动物模型来测试我们新构建的靶向纳米核磁造影剂的有效性。MDA-MB-231-luc细胞转染了北美萤火虫荧光素酶基因，表达高水平的转铁蛋白受体。细胞常规培养在含10%小牛血清的DMEM/F-12培养基中。8到10周左右的胸腺缺陷型雌性裸鼠(Harlan,Indianapolis,IN)用于制作皮下肿瘤模型。1伊107个细胞悬浮于100滋lDPBS中注射于裸鼠后背皮下。直径0.4至1.2cm的肿瘤用于试验。1.3共聚焦显微镜观察MDA-MB-231-luc细胞培养在8孔细胞培养板上，培养24小时达到40%至50%后，吸去原培养基，加入150滋l含25滋l探针(TfNIR-LipNBD-Magnevist,Tf-LipNBD-dye或单独Alexa680)的无血清、无抗生素培养基，分别培养5、30、60、120分钟。之后，用PBS溶液洗3次，用10%的福尔马林溶液固定10分钟。细胞核用4,6-二氨基-2-苯吲哚（DAPI）复染。细胞在ZeissLSM510共聚焦显微镜下观察。用激发波长633nm和发射波650nm来观察TfNIR或Alexa680荧光剂，用激发波长488nm和发射波505~550nmfilter来观察LipNBD绿色荧光，并用激发波长364nm和发射波385~470nmfilter检验DAPI蓝色荧光。1.4靶向纳米造影剂TfNIR鄄LipNBD鄄Magnevist体外靶向特异性影像分析细胞培养在10cm直径的培养皿中，至细胞占316第4期转铁蛋白导向脂质体核磁造影剂纳米粒子（TfNIR鄄LipNBD鄄Magnevist）———一种肿瘤靶向磁共振造影剂据80%面积，吸去培养液，加入3ml含200滋l各种不同探针（TfNIR-LipNBD-Magnevist,Tf-LipNBD-dye,LipNBD-dye,Magnevist或Alexa680）的培养基，培养60分钟。用PBS溶液洗3次后，收集细胞并调节至相同数目。经离心后，细胞团块通过XenogenIVIS200光学成像仪（CaliperLifeScience,Hopkinton,MA）成像并定量荧光强度。不同探针处理的细胞荧光强度用微软Excel软件做统计分析。在核磁共振成像，用150cm2培养瓶培养细胞，吸去培养液，加入10ml含600滋l探针的培养液。培养60分钟后，用PBS溶液洗3次，收集细胞并调节至相同数目。离心后，细胞团块用Bruker400MHz的核磁共振仪，spin-echo（SE）、T1-weighted成像方法检测。成像参数是echotime(TE)=11.416ms、repetitiontime(TR)=500ms，采样重复4次，影像尺寸为20mm伊20mm，matrixsize=256伊128，影像厚度为2mm。T1测量方法用FISP-T1（fastimagingsteadystateprecessionimagingsequence）程序，参数是：TE=1.5ms、TR=3ms，采样重复8次，16frames，32segments，inversiondelay49.2ms，repetitiontime2572ms。核磁共振的影像取自微离心管内细胞团块的中段。所有的成像最终用Bruker公司图像分析软件来分析。每项体外实验至少重复3次。1.5靶向纳米造影剂TfNIR鄄LipNBD鄄Magnevist体内靶向特异性及有效性影像分析为了评价TfNIR-LipNBD-Magnevist的肿瘤靶向性，在MDA-MB-231-luc肿瘤模型，首先用XenogenIVIS200光学呈像仪进行光学成像。成像和信号的定量由LivingImage(CaliperLifeScience,Hopkinton,MA)软件控制。小鼠放置于避光的Xenogen机器内的保温平台上，用2%异氟烷持续麻醉小鼠。小鼠通过尾静脉注射200滋lTfNIR-LipNBD-Magnevist探针（含12滋lMagnevist）。每10～30分钟成像一次，连续成像至6小时。每次呈像时间1秒。然后，测定肿瘤部位荧光信号强度。信号强度用平均流量〔光子/(秒·cm2·球面度)，p/(s·cm