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课题3血红蛋白的提取和分离情境导引为年老多病的人注射丙种球蛋白，可以在一定程度上增强其身体的抵抗力。在动物体内，丙种球蛋白和许多蛋白质混合在一起。要获得纯净的丙种球蛋白制品，就必须进行提取和分离。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现了样品中各种分子的分离。蛋白质分离的原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。一、基础知识（一）凝胶色谱法2.凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。1.概念：（分配色谱法）洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子•相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个•B3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢•思考：所有的蛋白质都可以用凝胶色谱法来分离吗？进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？不是，能分离的蛋白质分子必须是具有相对分子质量不同的蛋白质。1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。2、作用：能够抵制（）对溶液的（）的影响，维持PH基本不变。外界的酸或碱PH值（二）缓冲溶液3、缓冲溶液的配制通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。1－2使用比例在不同PH范围内思考：说出人体血液中缓冲对？NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？三、电泳---血红蛋白的分离鉴定方法1.概念：带电粒子在作用下发生的过程。2.原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有的基团，在一定的PH下，这些基团会带上或。在电场的作用下，这些带电分子会向着的的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子以及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。电场迁移可解离正电负电与其所带电荷相反带电性质的差异大小形状迁移速度3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。影响蛋白质分子运动速度的因素决定运动方向电场作用力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√聚丙烯酰胺凝胶电泳在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。1.原理：SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。2.SDS作用机理:用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理—粗分离（透析）—纯化—纯度鉴定（电泳）血液血浆水分其他物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团1.血液有哪些成分？二、实验操作：知识回顾每个肽链环绕（），此基团可携带（）。血红蛋白因含有（）而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳血红素2与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义?鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白答:血红蛋白是有色蛋白,因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液.这使血红蛋白的分离过程非常直观,大大简化了实验操作.1.你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠）（二）操作过程防止血液凝固1、样品的处理（1）红细胞的洗涤A、洗涤目的:B、分离时采用离心，用洗涤，重复洗涤，直至为什么要低速短时离心？防止白细胞沉淀（P69）C、能否用蒸馏水代替生理盐水？去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化低速短时间五倍体积的生理盐水三次上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。D、为什么要缓慢搅拌？防止红细胞破裂释放出血红蛋白。洗涤过程图解：血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色再加入用（）的（）质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤,缓慢搅拌10MIN，（）离心.五倍体积如此重复洗涤（）次，直至上清液中已没有（），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。三黄色生理盐水低速短时间初次离心后的结果3次洗涤后的结果（2）释放血红蛋白思考：1.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？2.为了加速释放过程，采取了什么措施？（使用磁力搅拌器充分搅拌）目的分析：1.蒸馏水的作用是______________________________。2.加入甲苯的作用是____________________________。3.充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂（蒸馏水，40%体积的甲苯）磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器正在工作3.分离血红蛋白溶液：•将搅拌好的混合溶液转移到离心管中，以2000r/mim的速度离心10mim后，可以看出溶液分为4层，从上往下数，第一层是无色透明的甲苯层，第二层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层，第三层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀物，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体第1层：（）甲苯层第2层：（）色薄层固体（）的沉淀层，第3层:（）的液体（）的水溶液层第4层:其它杂质（）的沉淀层无色透明脂溶性物质白血红蛋白红色透明暗红色用过滤，除去，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。滤纸脂溶性沉淀层.分离血红蛋白分离过程:红细胞混合液高速离心10min离心管滤纸过滤脂类物质烧杯2.粗分离----透析（去除分子量较小的杂质）（1）用方法进行粗分离，透析袋由半透膜制成，常用。将透析袋放入溶液中进行透析。（2）透析的原理是（3）透析的目的是。透析玻璃纸、肠衣、膀胱膜透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内去除样品中分子量较小的杂质磷酸缓冲取()ml的血红蛋白溶液装入（）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的（）中，pH为（），透析12小时，目的是（）或用于更换样品中的（）。除去样品中分子量较小的杂质透析袋磷酸缓冲液7.0缓冲液4.透析（粗分离）1•透析过程中如何去除无机盐离子和小分子有机物？•半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。•透析过程中为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？•维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。（一）样品处理1、红细胞的洗涤：2、血红蛋白的释放：3、分离血红蛋白溶液：4、透析：（如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明液体。装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定（二).凝胶色谱操作----1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：教材图5－193.样品的加入和洗脱血红蛋白的纯化2.凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。装配好的凝胶柱（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。50cm高（2）凝胶色谱柱的装填（3）样品加入与洗脱①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。•③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口•④洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。•⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱