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1课时跟踪检测(三十五)基因工程1．(2014·江苏高考改编)下列关于基因工程技术的叙述，正确的是()A．切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列B．PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应C．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因D．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达2．(2014·重庆高考)下面是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是()A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异3．(2014·宁波效实月考)2007年诺贝尔生理学或医学奖授予马里奥·卡佩基等三位科学家，以表彰他们“在涉及胚胎干细胞和哺乳动物DNA重组方面的一系列突破性发现”。这些发现导致了“基因敲除”技术(通常叫基因打靶)的出现，利用这一技术可以准确地“敲除”DNA分子上的特定基因，从而为研究基因功能开辟了新途径。该技术的过程大致如下：第一步：分离胚胎干细胞。从小鼠囊胚中分离出胚胎干细胞，在培养基中扩增。这些细胞中需要改造的基因称为“靶基因”。第二步：突变DNA的体外构建。获取与靶基因同源的DNA片断，利用基因工程技术在该DNA片段上插入neoR基因(新霉素抗性基因)，使该片段上的靶基因失活。第三步：突变DNA与靶基因互换。将体外构建的突变DNA转移入胚胎干细胞，再通过同源互换，用失活靶基因取代两个正常靶基因中的一个，完成对胚胎干细胞的基因改造。第四步：将第三步处理后的胚胎干细胞，转移到添加新霉素的培养基中筛选培养。其基本原理如下图所示：请根据上述资料，回答下列问题：(1)“基因敲除技术”以胚胎干细胞作为对象是因为胚胎干细胞具有________性。(2)在第三步中，涉及的变异类型是________。(3)在靶基因中插入neoR基因的目的________________________________________。2(4)假设经过上图表示的过程，研究者成功获得一枚“敲除”一个靶基因的胚胎干细胞，并培育成一只雌性克隆小鼠，则：①该克隆小鼠的后代是否都含有neoR基因，为什么？________，__________________。②简述如何利用上述小鼠才能获得符合需要的小鼠：________________________________________________________________________________________________________________________________________________。③若该克隆雌鼠与普通小鼠交配，理论上该克隆雌鼠产下抗新霉素小鼠与不抗新霉素小鼠的比例为________。4．我们日常吃的大米中铁含量极低，科研人员通过基因工程等技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了稻米的营养品质。下面为培育转基因水稻过程示意图，请回答：(1)在上述工程中，铁结合蛋白基因称为________，获取该基因后常用________技术进行扩增。(2)构建重组Ti质粒时，通常要用同种限制性核酸内切酶分别切割______________________________和________。将重组Ti质粒转入农杆菌时，可以用________处理农杆菌，使重组Ti质粒易于导入。(3)将含有重组Ti质粒的农杆菌与水稻愈伤组织共同培养时，通过培养基2的筛选培养，可以获得________________；培养基3与培养基2的区别是______________________。(4)检测培育转基因水稻的目的是否达到，需要检测转基因水稻________________。5．浙江大学农学院喻景权教授课题组研究发现，一种植物激素——油菜素内酯能促进农药在植物体内的降解和代谢。用油菜素内酯处理后，许多参与农药降解的基因(如P450基因和红霉素抗性基因)表达和酶活性都得到提高，在这些基因“指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒甚至无毒物质，有的则被直接排出体外。某课题组进一步进行了如下的实验操作，请回答下列问题：3(1)获得油菜素内酯合成酶基因的方法有____________、____________________。步骤①用PCR技术扩增基因时用到的耐高温酶通常是指____________________；步骤②用到的酶有__________________________。(2)图中导入重组质粒之前应用________处理受体细菌。(3)导入重组质粒2以后，往往还需要进行检测和筛选，可用________________制成探针，检测是否导入了重组基因，在培养基中加入________可将含有目的基因的细胞筛选出来。(4)请为该课题命名：_______________________________________________________。6．(2014·天津高考)嗜热土壤芽孢杆菌产生的β葡萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶，为使其在工业生产中更好地应用，开展了以下试验：Ⅰ.利用大肠杆菌表达BglB酶(1)PCR扩增bglB基因时，选用______________基因组DNA作模板。(2)下图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入________和________不同限制酶的识别序列。(3)大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述构建好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为_________________________________________________________________。Ⅱ.温度对BglB酶活性的影响(4)据图1、2可知，80℃保温30分钟后，BglB酶会________；为高效利用BglB酶降解纤维素，反应温度最好控制在________(单选)。A．50℃B．60℃C．70℃D．80℃4Ⅲ.利用分子育种技术提高BglB酶的热稳定性在PCR扩增bglB基因的过程中，加入诱变剂可提高bglB基因的突变率。经过筛选，可获得能表达出热稳定性高的BglB酶的基因。(5)与用诱变剂直接处理嗜热土壤芽孢杆菌相比，上述育种技术取得热稳定性高的BglB酶基因的效率更高，其原因是在PCR过程中________(多选)。A．仅针对bglB基因进行诱变B．bglB基因产生了定向突变C．bglB基因可快速累积突变D．bglB基因突变不会导致酶的氨基酸数目改变答案1．选D限制性核酸内切酶大多是特异性识别6个核苷酸序列，但也有识别序列由4、5或8个核苷酸组成的；PCR中耐高温的DNA聚合酶只是在延伸阶段发挥催化作用；载体质粒上抗生素抗性基因可作为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，不是抗生素合成基因；目的基因导入了受体细胞不一定就都能正常表达。2．选D构建重组质粒需要用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶，不需要DNA聚合酶，含重组Ti质粒的农杆菌侵染植物细胞后，重组Ti质粒的TDNA整合到受体细胞的染色体上，而不是重组Ti质粒整合到受体细胞的染色体上，导入受体细胞的目的基因表达后，转基因植株方能表现出相应性状，若目的基因在受体细胞中不表达，转基因植株不能表现出相应性状，⑤表现出抗虫性状则表明该植株细胞发生了基因重组，基因重组是可遗传变异。3．解析：(1)胚胎干细胞有发育的全能性，较易通过克隆获得克隆后代。(2)通过同源交换用突变DNA替换靶基因，与交叉互换类似，属基因重组。(3)在靶基因中插入neoR基因可以造成靶基因不能正常表达而失活，同时插入的neoR基因是抗生素抗性基因可作为标记基因用于基因敲除细胞的筛选。(4)由图示可知该克隆小鼠的一对靶基因只敲除了一个，另一个还正常起作用，所以该克隆小鼠可视为杂合子，在形成配子时等位基因会发生分离，产生不含neoR基因和含neoR基因的两种配子，比例为1∶1。若该克隆雌鼠与普通小鼠交配，理论上该克隆雌鼠产下抗新霉素小鼠与不抗新霉素小鼠的比例也为1∶1。因此其后代并不5会都含neoR基因。“符合需要的小鼠”应当是两个靶基因都敲除的个体，可以让该克隆小鼠与多只普通小鼠交配，让子代与该克隆小鼠回交或子代小鼠间自由交配，筛选突变型的纯合子。答案：(1)发育全能性(2)基因重组(3)使靶基因失活和用于基因敲除细胞的筛选(4)①否因为该克隆小鼠可视为杂合子，在形成配子时等位基因会发生分离，产生不含neoR基因和含neoR基因的配子②先让该克隆小鼠与多只野生型小鼠交配然后让子代与该克隆小鼠回交或子代小鼠间自由交配，筛选突变型的纯合子③1∶14．解析：本题中培育转基因水稻的目的是获得铁含量比普通大米高的大米，因此目的基因为铁结合蛋白基因，要大量获得此基因一般采用PCR技术进行扩增。要构建重组质粒要用同种限制性核酸内切酶切割含目的基因的DNA片段和质粒。将外植体培养成试管苗的过程要用到不同的培养基，各培养基最明显的差别在于所添加植物激素的比例不同。答案：(1)目的基因PCR(2)含目的基因的DNA片段质粒CaCl2(3)含有重组质粒的愈伤组织生长素和细胞分裂素的浓度比例(4)种子中铁含量5．解析：进行基因工程操作时，首先要获取目的基因，其方法有多种：从基因文库中获取、人工合成目的基因或PCR合成等。在构建基因表达载体的过程中，用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶。图中的受体细胞是细菌，导入后，需检测和筛选。从图中可以看出，最终是通过对照实验来检验转基因细菌对土壤中残留农药的分解能力。答案：(1)从基因文库中获取人工合成目的基因或PCR合成耐热的DNA聚合酶限制性核酸内切酶和DNA连接酶(2)氯化钙溶液(3)红霉素抗性基因红霉素(4)油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解6．(1)BglB酶是嗜热土壤芽孢杆菌产生的一种耐热纤维素酶，因此在该菌体内存在相应的基因，利用PCR扩增bglB基因时，应选用嗜热土壤芽孢杆菌的基因组DNA作模板。(2)要使目的基因插入在启动子和终止子之间，而且不能破坏启动子、终止子、复制原点、抗生素抗性基因等部位，只能选用NdeⅠ和BamHⅠ限制酶切割质粒和目的基因，因此在扩增的bglB基因的两端需分别引入NdeⅠ和BamHⅠ不同限制酶的识别序列。(3)bglB基因能够编码BglB酶(一种纤维素酶)，BglB酶能分解纤维素。大肠杆菌不能降解纤维素，但转入bglB基因的大肠杆菌能分泌有活性的BglB酶，获得了降解纤维素的能力。(4)根据图1可知，80℃下BglB酶活性接近于0，由图2可知，BglB酶在80℃保温30分钟后，其相对活性为0，因此80℃保温30分钟后，BglB酶会失活；BglB酶的最适温度在60～70℃之间，而在70℃下保温一段时间后酶活性逐渐降低，因此为高效利用该酶降解纤维素，反应温度最好控制在60℃。(5)在PCR扩增bglB基因的过程中，加入诱变剂可提高bglB基因的突变率，该过程中诱变剂只针对bglB基因进行诱变，而用诱变剂直接处理嗜热土壤芽孢杆菌，是针对嗜热6土壤芽孢杆菌内的所有基因进行诱变，A正确；基因突变是不定向的，用诱变剂处理bglB基因不能产生定向突变，B错误；在PCR扩增bglB基因的过程中，加入诱变剂可快速累积突变，而用诱变剂直接处理嗜热土壤芽孢杆菌则不能，C正确；BglB酶是由bglB基因编码的，基因突变是指基因的内部结构发生改变(碱基对的增添、缺失或改变)，可能会导致酶的氨基酸数目改变，D错误。答案：(1)嗜热土壤芽孢杆菌(2)NdeⅠBamHⅠ(3)转基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB酶(4)失活B(5)A、C