2015年基因工程实验手册

《本科实验教学》基因工程实验指导贵州大学农业生物工程研究院2015年4月实验一DNA片断的连接、转化及酶切鉴定一、实验原理：实验所用载体为Promega公司T载体pGEM®-TEasyVector，特点为在载体中存在两个T末端。使用LATaq进行扩增得到的大部分PCR产物3’端附有一个“A”碱基。T4噬菌体DNA连接酶可在体外使外源DNA片段和线状质粒载体之间形成新的3'，5'磷酸二酯键。PCR胶回收产物游离A末端与载体的T末端可互补配对并在连接酶作用下连接形成重组质粒。转化指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA分子导入受体细胞体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。大肠杆菌转化常用化学法（CaCl2法），其原理是培养至对数生长期的细菌在0℃经过低渗CaCl2溶液致敏处理，就可以成为高效的感受态细胞，这种感受态细胞与质粒混匀置于0℃30min，混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，再经42℃短时热激处理，促使质粒进入细胞实现转化，利用质粒上的遗传选择标记在LB平板上进行初步筛选转化菌落。蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补，抗生素基因等（本实验中使用的T载体pGEM®-TEasyVector本身具有Amp抗性）。现在使用的许多载体都有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，β-半乳糖苷酶基因在缺失近操纵区段的宿主细胞与带有完整近操纵区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由于α-互补而产生的β-半乳糖苷酶基因和细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时，可产色蓝色菌落，易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，宿主细胞与质粒之间不能形成α-互补，从而使带有重组质粒的细菌形成白色菌落。对培养的含有大量质粒的菌液，离心收集菌体。用含有一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体，采用碱性SDS（十二烷基硫酸钠）溶液裂解菌体的细胞壁，使质粒缓慢释放出来，同时整个液体的pH为12-12.5，双链DNA变成单链，当pH调至中性并有高盐浓度存在下，绝大多数变形质粒恢复自然状态溶在液体中，而变形染色体不能复性，断裂呈线性的单链细菌染色体DNA相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上与蛋白质形成沉淀，离心获得含有大量质粒的上清液，再利用适当浓度的亲水性有机溶剂（乙醇、异丙醇）使质粒DNA脱水，离心等到质粒沉淀。限制性内切酶能识别并切割特异位点的DNA序列。其被广泛应用于载体构建。提取的质粒DNA，利用限制性内切酶EcoRI（GAATTC）进行酶切，可将目的基因切下。酶切结果可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。二、实验材料PCR胶回收产物，pGEM®-TEasyVector（Promega），已制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞三、实验仪器PCR仪、制冰机、水浴锅、37℃摇床、离心机、涡旋振荡器、电泳槽四、实验试剂1.SolutionⅠ（0-4℃保存）:50mmol/L葡萄糖；25mmol/LTris·Cl(pH8.0)；10mmol/LEDTA(pH8.0)2.SolutionⅡ(现配现用):0.2mol/LNaOH；1%SDS3.SolutionⅢ（0-4℃保存）:0.2mol/LKAC60mL；冰乙酸11.5ml；ddH2O28.5ml(pH4.8)4.Rnase:100mgRnase粉剂，溶于10ml10mmol/LTris·Cl(pH7.5),15mmol/LNaCl缓冲液中，水浴煮沸15min,冷却，－20℃保存。五、实验步骤1.PCR产物的连接于冰水浴中配制如下反应体系。总体积10.0μLT4DNA10×ligBuffer1.0μLpGEM®-TEasyVector1.0μLPCR产物3.0μLT4DNA连接酶1.0μLddH2O4.0μL用移液枪吹打连接反应使之混匀后，4℃孵育过夜。2.连接产物转化大肠杆菌（1）将-80℃保存的DH5α感受态细胞置于冰中溶解10min。（2）取100μL感受态细胞至新的1.5mL离心管中。（3）向感受态细胞中加入0.1ng-10ng（约7ul）转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30min。（3）42℃水浴锅中放置45s后，立即冰中放置2min。（4）加入890μL37℃预温的LB培养基。（5）37℃,200rpm振荡培养1h，4000×g，室温离心1min。（6）倒掉上清，向沉淀中加入100μLLB液体培养基后充分混匀，取30μL悬浮菌液涂布于LB抗性平板（2%X-Gal：40μL；24mg/mLIPTG：7μL；100mg/mLAmp：30μL）。（5）37℃下倒置培养12-16h，挑选白色单菌落扩增培养。3.质粒DNA的提取（1）将含有目的基因的阳性克隆菌落从LB抗性平板上接种到5mL含有Amp的LB液体培养基中，37℃,200rpm，过夜摇菌。（2）取1.5-5.0mL菌液至1.5mL离心管中，10,000×g，4℃，离心1min，倒掉上清液。重复操作一次。（3）向沉淀中加入150μL的SolutionⅠ，涡旋震荡，直至没有沉淀。（4）加入200μLSolutionⅡ，轻柔的上下翻转离心管数次，使之混匀，冰中放置3min（加入SolutionⅡ后在冰上放置不要超过5min）。（5）加入150μLSolutionⅢ后立刻混匀，冰中放置3min。（6）10,000rpm，4℃，离心10min，将上清液转移到另一离心管中。（7）加入2倍体积的无水乙醇（约700μL），颠倒离心管数次以混合，-20℃放置20min。（8）10,000rpm，4℃，离心10min，弃上清液。（9）加入1mL70%乙醇洗涤DNA沉淀。（10）去掉上清液，倒扣于吸水纸上几分钟，在空气中使沉淀干燥或真空抽干，干燥的标志为白色沉淀变为半透明或透明。（11）加入18μLddH2O溶解沉淀，加2μLRNase（100g/mL），使RNA酶终浓度为20g/mg，振荡，37℃度保温40分钟。（12）-20℃保存备用。4.质粒DNA的酶切（1）于冰水浴中配置如下反应体系。ddH2O7.9μL10×HBuffer1.0μL质粒0.6μLEcoRI0.5μL总体积10.0μL（2）用移液枪吹打反应体系使之混匀后，37℃反应30min。（3）电泳检测六、实验结果分析：本实验中连接形成的重组质粒具有Amp抗性，转化细胞可在相应培养基中形成菌落，在IPTG和X-Gal作用下形成蓝白斑。转化大肠杆菌铺板后12-16h观察抗性菌落及蓝白斑。附照片。提取的质粒，利用限制性内切酶EcoRI进行酶切，可将目的基因切下。酶切情况通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，照相。七、注意事项：1.实验中所有酶均需于冰上操作。2.严格按照规定使用酶的用量3.电泳时注意自身防护，切勿手触试剂4.大肠杆菌感受态一定放冰上进行实验操作。5.热激和冰浴时间要准确。实验二农杆菌介导的烟草遗传转化一、实验原理根癌农杆菌携带的Ti质粒T－DNA区片断能在诱导物的作用下进入植物细胞并整合到植物核基因组中。由于植物细胞的全能性，在无性繁殖的过程中，携带外源基因片断（T-DNA片断）的植物细胞经诱导培养再生后得到完整的转基因植株。二、实验材料植物材料烟草Nicotianatabacumcv.K326农杆菌根癌农杆菌EHA105培养基共培培养基：MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+3%sucrose+0.7%agarpH5.80筛选培养基：MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+3%sucrose+0.7%agar+100mg/LTemetin+100mg/LKmpH5.80生根培养基：MS+sucrose2%+0.75%agar+100mg/LTemetin+100mg/LKmYEP培养基：10g/Lpeptone，10g/LYeastExtract及5g/LNaCl。pH:7.20重悬液:MSpH5.80实验仪器：超净工作台摇床离心机三、实验步骤烟草叶片材料的准备烟草叶片经75%酒精消毒30s，0.1%升汞消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次后，取消毒后的烟草叶片，切去叶片边缘,再将叶片切成约0.5cm*0.5cm见方的叶盘。农杆菌的培养及活化1.用接种针蘸取-80℃冻存的农杆菌在YEP（20mg/Lrif，50mg/Lkm，1.5%agar）固体培养基上活化，28℃恒温培养24小时左右，直到长出合适大小的菌斑。2.用牙签挑取农杆菌单菌落放入5mlYEP（20mg/Lrif，50mg/Lkm）培养基中，200rpm28℃震荡培养24小时左右。3.于5ml菌液中取500-1000ul加入到50mlYEP培养基中，200rpm28℃振荡培养，至OD600值达到0.4-0.7。将菌液转移到50ml离心管中，6000rpm，4℃离心10min，收集菌体。遗传转化1.用MS重悬液重悬农杆菌菌液，调节OD600为0.3～0.4。2.将烟草叶片放入重悬菌液中，浸泡6min。3.将侵染过的烟草叶片，用滤纸蘸干，紧密排列于共培养基中；25-26℃黑暗条件下共培养三天。4.将共培养3天的烟草叶片，转接于筛选培养基中。5.10d继代一次，4周后即有愈伤组织的形成和芽的分化。6.待筛选后的绿芽长到2cm高左右时，切下绿芽转入生根培养基。7.待抗性苗长至8-10cm时，炼苗移栽至花盆中，继续培养，直至收获种子。四、实验结果分析：1.烟草叶片在筛选培养基上培养4d后，观察材料的污染情况；2．烟草叶片在筛选培养基上培养21d后，观察材料的愈伤诱导及芽诱导情况，并统计出芽率。出芽率=诱导出芽外植体数/接种外植体数；（留出位置附照片）五、注意事项：1.留出一部分叶盘做对照，暗处共培养3d。2.叶盘要放平，使其边缘与培养基充分接触，保证未转化的细胞处于选择压力下。3.爱护实验室仪器以及药品，实验时不要大声喧哗，保持安静。4.酒精灯、锋利刀片要正确使用，注意安全。实验三转基因植物表型观察、GUS（β-葡萄糖醛酸糖苷酶）表达活性分析及鉴定一、实验原理BAS1基因是调控油菜素内酯分解代谢的基因，该基因能使油菜素内酯活性降低，从而影响转基因植株的生长发育。GUS基因是转基因植物使用较多的一种报告基因，具有检测快速简洁高效的特点。GUS组织化学法染色原理为：适宜的反应条件下（一般37℃），取实验材料、加入GUS酶的将底物X-Gluc（5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），在酶的活性部位产生沉淀，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在95°高温时变性会变成单链，低温（一般是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。利用BAS1基因的引物扩增植株基因组DNA，从而鉴定是否为转基因植株。二、实验材料1.植物材料转BAS1基因烟草叶片（实验室提供）2.试剂（1）10×Buffer(10ml)1MTris(pH7.5)10mlNacl290mgK3Fe(CN)666mg（2）染液(10ml)10×Buffer1mlMethanol(甲醇)2mlX-Gluc5mgWater7ml三、实验仪器注射器、37℃恒温箱等四、实验步骤1.表型观察观察转基因烟草与非转基因烟草形态等差异变化。2.GUS染色（1）取转BAS1基因烟草叶片徒手切成细丝后放入置于PCR管中，用注射器反复抽真空5-6次；（2）加入GUS染液10µl，置37℃恒温培养箱放置0.5-3h或者放置过夜反应；（3）吸取染液，依次分别加入各1mL20％、50％、70％、100％乙醇脱色，