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蛋白样品制备全攻略双向电泳可不是一件容易的差事，花银子花时间不说，结果还很难重复。想要搞定双向电泳，关键在于建立一套有效、可重复的样品制备方法。方法是多种多样的，不过都基本遵循以下的原则：1.样品缓冲液中离子浓度的控制2.溶解包括疏水蛋白在内的所有蛋白质3.防止聚焦过程中已溶解蛋白质的聚焦和析出4.防止样品制备过程中及其后蛋白样品的酶或化学降解等的修饰反应5.去除或完全降解核酸及其他干扰分子6.去除高丰度或不相关的蛋白质，提高低丰度蛋白的浓度，使其达到检测要求提高分辨率和确保重复性是双向电泳实验昀重要的两个目标。蛋白样品制备在实现这两个目标的过程中起到了核心作用。Bio-Rad公司的ReadyPrep试剂盒通过试剂增溶或差异溶解来减少脱尾或降低样品复杂性，从而成为用户可靠的实验工具。ReadyPrep产品线包含一系列2-D样品制备试剂盒，不仅适用于通用样品（总蛋白）处理，而且可以将复杂样品按特定方法分级。处理通用样品的试剂盒包括总蛋白抽提和蛋白净化（clean-up）。样品分级试剂盒可用来降低样品复杂程度，同时有助于低丰度蛋白的富集和鉴定。这类试剂盒又分为两种，一种是基于蛋白不同的亚细胞定位来分离，另一种是对细胞总蛋白进行分级，从而适合于总蛋白质组分析。从血清或血浆中提取的低丰度蛋白经常会受到白蛋白和IgG的干扰。白蛋白在血清总蛋白中的含量约为60-70%，IgG虽小，也不可轻视，占了总蛋白的约10-20%。这两种蛋白异军突起，常常掩盖了其它类似大小的蛋白，使我们无视低丰度蛋白的存在，也降低了双向电泳的分辨率。因此，在分析目的蛋白之前，我们一定要先干掉白蛋白和IgG这两个家伙。样品中的核酸会对等电聚焦的结果产生干扰：DNA复合物在变性条件下发生解离而使溶液的粘稠度增加，可阻碍蛋白质进入IPG胶条，并减慢蛋白质在胶条中的移动速度。DNA也会与样品中的某些蛋白质结合，出现人工假象和条纹。具体的解决方案如下：去除盐分、去垢剂、脂类、酚类ReadyPrep2-D净化试剂盒ReadyPrep2-D净化试剂盒可去除蛋白样品中的去垢剂、盐分、小肽、脂类和酚类化合物。这些物质会干扰双向电泳。本试剂盒含有不受去垢剂、离液剂或其它实验中常用试剂干扰的沉淀试剂，可充分沉淀样品蛋白，并保证了蛋白样品的回收效率和浓度。去除白蛋白AurumAffi–Gel蓝胶小型试剂盒和层析柱通过亲和层析，Affi–Gel蓝胶能去除血清和血浆中90%的白蛋白。去除白蛋白/IgG页，共21页下一页返回Aurum血清蛋白Mini试剂盒Aurum血清蛋白Mini试剂盒包含了MicroBio-Spin层析柱，其中填充了Affi-Gel蓝胶和Affi-GelProteinA填料。这两种树脂混合物能同时选择性地结合白蛋白和IgG，处理过的样品无需额外纯化，就能立即用于2D的分析。一次纯化就能搞定两个东西，操作步骤减少了，效率也提高了。去除DNA昀简单的方法就是酶解。当样品用高pH溶液裂解后，在溶液中加入核酸内切酶，既能有效降解核酸，又能使内源性蛋白酶的活性昀低。也可以在冰浴环境中，通过超声处理的方法将大片段的核酸打断成小片段后，直接进行双向电泳。总蛋白抽提ReadyPrep蛋白抽提试剂盒(总蛋白)ReadyPrep蛋白抽提试剂盒(总蛋白)是一种操作简单、快捷、重复性好的试剂盒，用来抽提适合于双向电泳的细胞全蛋白。试剂盒中离液性超强的抽提溶液含有兼性去垢剂ASB-14，从而使该溶液能溶解各种细胞的全蛋白。根据亚细胞定位分步抽提ReadyPrep蛋白抽提试剂盒(膜I)本试剂盒是利用TritonX-114在一定温度下可与水相分层的原理将蛋白分离。经过昀后一步的离心步骤，溶液被分级成上层的水相和下层的高去垢剂相。此外还有一些难溶的沉淀，这些沉淀主要是更加复杂的膜蛋白。进入上下两相的蛋白再用ReadyPrep2-D净化试剂盒(含在本试剂盒中)净化，以去除抽提过程中混入的可能干扰IEF的物质。ReadyPrep蛋白抽提试剂盒(膜II)膜II试剂盒做为其它膜蛋白分离试剂盒的补充，是专门为有效分离较为复杂的膜蛋白而优化的。抽提的过程用到了碳酸钠和超速离心机。试剂盒中的2-D水化/上样缓冲液含有强离液性的兼性去垢剂ASB-14。ReadyPrep蛋白抽提试剂盒(信号)绝大多数细胞的胞浆膜都有富含神经鞘磷脂和胆固醇的微区域（酯筏）。与这些脂筏相联系的蛋白往往是参与物质跨膜转运或信号转导的蛋白质。这类蛋白包括GPI锚订蛋白、caveolin、caveolae(caveolin-associatedproteins)、酰化酪氨酸激酶、G蛋白异三聚体，以及一些含跨膜结构域的蛋白(SimonsandIkonen1997,BrownandRose1992,PartonandSimons1995,Andersonetal.1992)。与胞膜当中这些富含酯类的微区域相结合的蛋白质在4°CTritonX-100的溶液中难溶。ReadyPrep蛋白抽提试剂盒(信号)利用这一原理将信号蛋白有选择性地加以回收。ReadyPrep蛋白抽提试剂盒(胞浆/核)ReadyPrep蛋白抽提试剂盒(胞浆/核)使用一种专门配制的缓冲液和差速离心将细胞核完整地分离出来(Dignametal.1983,ZerivitzandAkusjarvi1989)。本试剂盒包含一种强离液性的缓冲液，可有效溶解膜蛋白，并可直接用于双向电泳分离。如要对胞浆组分进行分析可以将蛋白样品先用试剂盒中带的ReadyPrep2-D净化试剂盒处理。根据不同的溶解度分步抽提ReadyPrep顺序抽提试剂盒2008年11月13日第四十七期第2页，共21页下一页返回ReadyPrep还原/烷化试剂盒ReadyPrep顺序抽提试剂盒是为全蛋白质组分析而设计的。本试剂盒将初始蛋白样品根据溶解性的不同分成三个组分。当蛋白的亚细胞定位不能确定时，本试剂盒还可以用来搜寻特定的蛋白。依照溶液溶蛋白能力的增加将蛋白样品进行顺序抽提可以溶解更多的蛋白，从而使蛋白质组的信息更全面。ReadyPrep还原/烷化试剂盒首先将半胱氨酸残基之间的二硫键还原，然后将还原出来的巯基烷化，使得这些基团永久保持还原状态。这样做有助于防止假蛋白点的出现并能让IPG胶条中更多的蛋白质转移到第二向的SDS-PAGE胶中。本试剂盒对分析碱性蛋白质特别有效。因为胶条碱性部位的DTT容易电离，在电场作用下迁移出IPG胶条，从而使胶条中DTT减少，蛋白质二硫键重新形成。绝大多数生物含有较多数量的碱性蛋白，这类蛋白的pI值高于pH7。ReadyPrep蛋白抽提试剂盒(可溶/不可溶)ReadyPrep蛋白抽提试剂盒(可溶/不可溶)可将细胞全部蛋白分为两个组分——以亲水性蛋白为主的可溶性组分和以疏水性蛋白为主的不可溶组分。这种简单的分级方法可有效降低样品的复杂性，提高低丰度蛋白的检测效率，从而在总体上改善总蛋白质组的分离效果。要想得到好的双向电泳结果，绝大多数样品都需要通过多次实验才能摸索到昀适宜的条件。所以革命尚未成功，同学仍需努力！保持蛋白的还原状态（生物通余亮）页，共21页下一页返回新一代的体外表达系统与其它表达系统相比，体外表达是获取蛋白的最快方法。从PCR或者质粒模板开始，到体外蛋白质的合成及功能检测仅需几个小时，省去了转化、转染、挑克隆等诸多繁琐的步骤，且不需要任何宿主菌，因此，特别适用于体外合成毒性蛋白及易受蛋白酶水解的蛋白质。市场上销售的体外表达系统多是由E.coliS30、兔网织红细胞或者麦胚的提取物衍生而来。这些系统往往有一个缺陷：常常有非特异性核酸酶和蛋白酶影响蛋白质合成。此外，细胞提取物就像一个“黑匣”，许多不确定因素会改变和影响下游实验。虽然上述这些不利因素可以通过以下方法部分克服，例如：使用经过基因工程改造的菌株、加入多种抑制剂等，但是，无论怎样，都不能从根本上解决问题。2001年，东京大学的TakuyaUeda博士和同事首次利用重组的元件在体外合成蛋白质，除了来自E.coli的高度纯化核糖体和rRNAs外，其余组份都是重组蛋白。这就是“PURE”系统，即ProteinsynthesisUsingRecombinantElements的缩写，后经日本东京的PostGenomeInstitute(PGI)商业化。NEB公司获得了PGI的授权，并经过优化改良，开发出新一代的PURExpress体外蛋白质合成试剂盒。PURE系统中的所有活性组份都来自于重组，避免了核酸外切酶，RNase和蛋白酶的污染，使DNA模板不被降解，表达的蛋白也不会有任何降解和修饰。转录和翻译过程仅需混合两管试剂，一步反应即可完成，省去大量实验时间，特别适合于高通量分析。PURE系统的组分■携带His-Tag的翻译因子-起始因子（IF1、IF2、IF3）-延伸因子（EF-Tu、EF-Ts、EF-G）-释放因子（RF1、RF2、RF3）-核糖体再生因子-20种氨基酸tRNA合成酶-甲硫氨酰tRNA甲酰转移酶■E.coli核糖体■E.colitRNAs■能量再生系统■NTPs、氨基酸、盐、缓冲液此外，试剂盒中应用重组T7RNA聚合酶应用于转录和翻译。PURE系统向体外转录和翻译蛋白质迈出了重要一步，避免了细胞提取系统的“黑匣”作用。PURE系统的优势和适用范围PURE系统比其他体外表达系统使用更方便，合成能力更强。昀为显著的优点就是去除了所有污染可能。该系统可用于表达绝大多数蛋白质，表达量超过100μg/ml。由于翻译混合液的背景表达很低，因此，合成后的蛋白质通页，共21页下一页返回常不需要提纯就可以直接用于检测。PURE系统中所有蛋白因子都是重组蛋白质并且融合有His-tag，以便“反向”纯化表达的蛋白质，正是由于系统成份的高纯度，产品寿命也得到了延长，试剂盒经得起反复冻融5次，而不影响其活性。■无核酸内切酶和蛋白酶活性，减少了样品降解■适用于环状和链型模板■方便使用，混合两管试剂后加入DNA模板■仅需约一小时就可完成蛋白质表达新一代的体外表达系统应该包含有特定的组分，无背景表达，并且在高表达的同时能够对各种蛋白质进行正确折叠。PURE系统就是向此方向努力的一个典型，改进的重组系统将更适用于不同用户的要求，如：表达膜蛋白、多亚基聚合体和特殊修饰蛋白等复杂蛋白；允许合成条件的改变，如：提高或降低温度、改变离子强度和调控氧化还原环境等。■纯化的组份为翻译、分泌和折叠提供更严格的控制■纯化步骤简便，转录/翻译成份可通过亲和层析去除■试剂经得起多次冻融（生物通余亮）PURE系统提供了以下几个优势：2008年11月13日第四十七期第6页，共21页下一页返回让蛋白想唱就唱革新的ProteoTuner技术探索蛋白功能是很多人的研究方向。蛋白过表达是其中最经典的方法，不过蛋白表达的调控可不是一件容易的事。你可以通过RNAi在RNA水平对蛋白进行调控，不过要想在蛋白水平直接进行调控，却无计可施。现在终于梦想成真了。Clontech公司革新的ProteoTuner系统就像一个收音机，让蛋白想唱就唱。ProteoTuner系统昀初是由斯坦福大学的ThomasWandless博士和他的同事开发的。2006年Wandless博士在Cell杂志上发表题为《Arapid,reversible,andtunablemethodtoregulateproteinfunctioninlivingcellsusingsyntheticsmallmolecules.》的文章。几天之内，他就收到超过五十个来自世界各地的研究团队的来信请求分享这组试剂。这项技术也受到了全世界的关注，很多公司希望将它商业化。昀终，表达巨头Clontech公司获得了专利授权。ProteoTuner系统让研究人员能利用小分子调控细胞内任何目的蛋白的表达水平，比RNAi更快更准。这项技术已经成功应用于多个物种和应用中，并在Cell、NatureMethod、JBC上发表了多