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Apoptosis细胞凋亡研究方法建立与评价蒋纪恺•研究生？•研究方向•研究立题（研究背景、发现问题、提出问题（？）、提出假设、解决问题的策略与方法）申请课题，获得经费•实验验证（实验模型、技术指标、方法建立与评价）•结果分析（撰写论文，申报专利，评奖）•研究方向：白血病•研究立题：肿瘤靶向治疗的分子机制研究。文献•阅读与学习。信号转导在白血病发生•与治疗的背景知识••研究模型：白血病细胞株；动物模型等•技术平台：实验技术的建立与评价，（技术指•标，动手能力）••结果分析：统计学知识，文献回顾•论文撰写：语言能力研究背景肿瘤治疗•手术•放疗•化疗•骨髓移植（白血病）增殖分化凋亡SurvivalGrowthDifferetiationApoptosis肿瘤Tumour立题依据•增殖：细胞通过分裂使细胞数目增加的过程，细胞分裂。（真核细胞的增殖方式有：有丝分裂、减数分裂、无丝分裂三种方式，只有连续进行有丝分裂的细胞才具有细胞周期。）•分化：在个体发育中，通过细胞分裂后产生的子代细胞比上一代细胞具有更专一的功能。后代在形态结构和功能上发生稳定性的差异过程称为细胞分化（cellulardifferentiation）。（比如血液中的红细胞、白细胞、淋巴细胞、血小板等都是从造血干细胞分化出来的，但是与造血干细胞相比，这些子代细胞都具有更加专一的功能。）•凋亡：细胞凋亡指的细胞的程序性死亡，细胞被自身的酶降解，按一定的步骤“自杀”，其死亡细胞仍为一整体，最终被白细胞吞噬。（而细胞坏死会有细胞壁破裂的现象，内含物外泄，会影响周围的细胞。）启动凋亡早期凋亡中期凋亡晚期Caspase激活★核染色质凝缩★细胞膜PS外翻★线粒体膜电位丧失★DNA被切割成片段凋亡小体形成信号通路研究模型•慢性粒细胞白血病（chronicmyelogenousleukemia，CML）•逆转•K562cellline分化（红系细胞）•增殖••凋亡药物诱导•K562cells•abcr:ablpositiveerythroleukamialinederivedfroma53yearoldfemaleCMLpatientinblastcrisis•Philadelphiachromosome•HL60(Humanpromyelocyticleukemiacells)•derivedfroma36-year-oldwomanwithacutepromyelocyticleukemiaattheNationalCancerInstitute研究方法建立与评价•灵敏度•特异性•蛋白质分析•1，染色•2，酶•3，免疫•分泌蛋白、膜蛋白、细胞质，细胞核蛋白方法学建立与研究策略•药物浓度的选择（MTT）•形态学观察（凋亡小体形成）•DNA被切割成片段•细胞膜PS外翻•Caspase激活•信号通路MTT测定细胞增殖•MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）是Mosmann1983年报告的。原理是活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物（MTT）由黄色还原为紫红（兰）色的甲（肷）紫,后者溶于有机溶剂（如二甲基亚枫、酸化异丙醇等）,甲紫（肷）产量与细胞活性成正比。可在560nm处用酶标仪测定其OD值。形态学观察DNA被切割成片段AnnexinV•基本原理细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。AnnexinV是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，AnnexinV具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用AnnexinV结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。细胞膜PS外翻Gossypol（24h）个体化靶向治疗Deficiency•ChineseherbalmedicineinChaoshanarea