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课题3血红蛋白的提取和分离思考1分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。一、基础知识：㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）2、概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快•用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质(D)•A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快•C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快4、具体过程•相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个B㈡缓冲溶液：1、作用：能够抵制（）对溶液的（）的影响，维持PH基本不变。外界的酸或碱PH值2、缓冲溶液的配制3.为什么在本实验中实用缓冲溶液在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）㈢电泳：1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2、原理：3.分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定（）通常用SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异二实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理—粗分离—纯化—纯度鉴定思考人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。•选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列是其优点的是(ABC)多•A．血红蛋白是有色蛋白•B．红细胞无细胞核•C．红细胞蛋白质含量高•D．红细胞DNA含量高1.样品处理血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（）90％1、样品处理•（1）、红细胞的洗涤：•（2）、血红蛋白的释放：•（3）、分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液有机溶剂（无色透明的甲苯层）脂类物质（白色脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液（红色透明液体）红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）2.透析(粗分离)a过程：b目的：c原理：除去样品中分子量较小的杂质透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。•（1）血红蛋白提取和分离的程度可分为四步：______、______、______和______。•（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。•①加入柠檬酸钠的目的是__________。•②以上所述的过程即是样品处理，它包括______、______、收集血红蛋白溶液。•（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。•①透析的目的是__________________。•②透析的原理是__________________。①去除分子质量较小的杂质②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内•（4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。•①样品纯化的目的是______________________________。•②血红蛋白有什么特点？__________。•这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液；这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。•下列操作正确的是（D）•A.分离红细胞时采用低速长时间离心•B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可•C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心•D.透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h•下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是()多A．采集血样后要高速短时问离心获得血细胞B．洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。C．在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白D．释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来BCD在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是DA洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐B洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果C洗涤过程选用0.1%的生理盐水D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质D3凝胶色谱操作（纯化）（1）凝胶色谱柱的制作：•凝胶色谱柱取长为40cm，内径为1．6cm，有关说法中，正确的是(ABD)多A．一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果B．凝胶色谱柱过高超过1m，不影响分离的效果C．凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度D．凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大ＡＣＤ（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：A、材料：B、代表意义：“G”表示。75表示②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。（2）凝胶色谱柱的装填50cm高（3）样品加入与洗脱①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。④洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。（3）样品加入与洗脱注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。•在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是A•A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果•B、气泡阻碍蛋白质的运动•C、气泡与蛋白质发生化学反应•D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密•样品的加入和洗脱的操作不正确的是A•A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面•B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内•C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口•D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面•下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（A）•A．可采集猪血作为实验材料B．用蒸馏水重复洗涤红细胞•C．血红蛋白释放后应低速短时间离心D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液二、实验操作•蛋白质的提取和分离一般分为四步：•（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。•（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。•（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。•（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。•下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述正确的是（ACD）多•A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液•B.通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取•C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化•D.可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度