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1늡풭짺컯톧폫쏢틟톧ퟛ뫏쪵퇩江汉大学医学与生命科学学院病原生物学教研室医学免疫学教研室2늡풭짺컯톧폫쏢틟톧ퟛ뫏쪵퇩主编宋文剑编者林莉许楚娟黄丽霞孔争胡松程喻力刘腊珍张慧张泽华刘锴2005年12月PDFcreatedwithFinePrintpdfFactoryProtrialversion前言病原生物学是研究病原生物的形态、结构、生命活动规律以及与机体相互作用关系的一门学科，主要包括医学微生物学和人体寄生虫学。医学微生物学主要研究病原微生物与人类疾病的关系问题，包括研究病原微生物的生命特征或生物学特性，致病性与致病机理、感染与免疫、特异性诊断和防治等问题；人体寄生虫学是研究人体寄生虫的形态结构、生活史、致病机制、实验诊断、流行规律与防治措施的一门科学；免疫学是研究机体免疫系统的组成、结构与功能、免疫应答的发生机制以及免疫学在疾病诊断与防治中应用的一门科学。以往，上述三门课分别设有实验课，按本科教学大纲共需实验学时52-78学时，其中实验内容有少量重复现象。本实验教材建立在上述三门学科理论及实验技术的基础上，以培养学生科学地创造性思维为出发点，强化基本技能训练的同时，加强了学科知识的横向联系，并为学生设计性、探索性实验提供了思路和空间。在编写过程中，力求条理清晰，简明实用，以病原生物感染的检查为主线，从常见的感染部位出发，将医学微生物学、医学寄生虫学及医学免疫学实验优化整合，剔除陈旧重复内容，融入学科技术发展新知识，并有机地将各学科知识贯穿于综合性实验之中，使之成为以上三门学科实验指导及重要辅助教材。全书包括两大部分，15个综合性实验项目，建议学时为48-54实验学时（不包括设计性实验所占用的课外时间），适用于本科临床医学专业和检验专业的学生使用。(宋文剑)PDFcreatedwithFinePrintpdfFactoryProtrialversion目录实验室基本操作方法及注意事项…………………………………………………………….3实验一病原生物的基本形态结构观察法及细菌的培养鉴定………………………….6实验二病原生物的基本形态结构观察及理化因素对它们的影响…………………...11实验三肠道病原的检查Ⅰ及抗原的制备………………………………………………15实验四肠道病原的检查………………………………………………………………2Ⅱ3实验五组织内病原Ⅰ......................……………………………………………………..31实验六组织内病原Ⅱ及血液内病原....…………………………………………………35实验七动物细胞免疫功能检测…………………………………………………………41实验八其他病原生物形态学检查……...………………………………………………44实验九医学节肢动物标本观察……………………………………….……...…………46实验十血吸虫病的诊断......................…....................................................….................51实验十一质粒DNA的小量制备………………………………………….………………...57实验十二核酸的琼脂糖凝胶电泳及限制型内切酶消化…………………………………62实验十三试管凝集反应（肥达反应）…………………………………………….…….66实验十四抗原抗体特异性的检测………………………………………………….……..69实验十五设计性实验……………………………………….……………………………..72参考文献附图1四种疟原虫形态附图2四种疟原虫形态鉴别要点PDFcreatedwithFinePrintpdfFactoryProtrialversion实验前必须掌握与实验相关的医学微生物学、医学寄生虫学及医学免疫学基础理论。做好预习，明确实验目的与实验内容。2.对于设计性实验，在老师的指导下，注意发挥自身潜能，勤于思考，灵活掌握所学知识。3.在实验过程中做到三严：严肃、严格、严谨。如实记录实验结果，按规定完成实验报告。对于失败实验结果要分析原因，必要时重复实验。4.严格遵守实验室规则。二.实验室规则1.进实验室穿工作服，离开时脱下，反折。2.除必需教材、文具外，其他物品禁止带入实验室。3.按规定位置就坐。保持实验室安静，不得随意走动、进出。4.实验室内禁止饮食、吸烟。谨防经口感染病原。5.实验操作应严格按实验指导和教师的要求进行。6.实验过程中若不慎将传染性标本污染桌面、手及其他物品时，应立即报告老师紧急处理，不得擅自处理。常见处理如下：（1）皮肤破伤：先除尽异物，用无菌生理盐水洗净后，涂以2%红汞或2%碘酒，必要时进行包扎。（2）灼伤：涂以凡士林油，5%鞣酸或2%苦味酸。（3）化学药品腐蚀伤：若为强酸，先用大量清水冲洗，再以5%碳酸氢钠或氢氧化铵溶液洗涤中和之；强碱腐蚀伤，则先以大量清水冲洗后，再用5%醋酸或5%硼酸溶液洗涤中和之。若受伤部位是眼部，经过上述步骤处理后，最后滴入橄榄油或液体石腊1、2滴，滋润之。（4）吸入病菌菌液：应立即吐入盛有消毒液的容器内消毒，并用1：1000高锰酸钾漱口；根据菌类不同，必要时需服药预防。（5）细菌污染衣物：应立即脱下，放入3%来苏尔或3%氯胺液内浸泡半小时，或仔细包好经高压蒸汽消毒后清洗。（6）菌液污染桌面：倾倒适量2-3%来苏尔或0.5%84消毒液于污染处，浸泡半小时后抹去。若手上沾有活菌，应浸泡于上述消毒液10-20分钟后，再以肥皂水冲刷之。7.看示教时，未经允许，不得移动显微镜推进尺。8.爱护实验室器材及设备，认真填写实验设备使用纪录。不慎发生损坏时，应立即报告老师，照章赔偿。PDFcreatedwithFinePrintpdfFactoryProtrialversion实验结束后，凡使用过的实验器材必须放在指定地点，如吸过菌液的吸管，毛细吸管要投入含有2-3%来苏尔或0.1%新洁尔灭的玻璃筒中，或置“待消毒”处，不得放在桌上，亦不可冲洗于水槽内。用过的波片也应放于含有消毒液的容器内。需要培养的实验材料集中后放入温箱中培养。10.实验完毕，应及时清理实验室（包括桌面，地面，试验用具等），值日生打扫室内卫生，管好门窗、水电。离开实验室前，将双手在消毒液内浸泡3-5分钟，再用清水洗净，方可离室。三.显微镜的使用（一）普通光学显微镜的基本结构光学显微镜的基本结构包括光学和机械两个部分。光学部分主要有目镜、物镜、镜筒、内置光源（或反光镜）、光阑等；机械部分包括镜座、镜臂、调节螺栓、载物台、夹持器、转换器、粗调焦手轮及细调焦手轮等。（见图1-1）图1-1光学显微镜的基本结构示意图（二）显微镜（油镜的使用）显微镜的物镜一般有低倍镜、高倍镜及油镜。病原生物学实验中最常用者为油镜。1.油镜的原理使用油镜时需在玻片上滴加香柏油。由于从标本玻片上透过的光线，因介质密度不同，部分光线发生折射散失，使射入物镜光线减少（高倍镜孔径较大，影响不显著），因油镜的孔径较小，进入的光线则不够，致使物象显现不清。当在油镜与标本片之间加香柏油后，香柏油折射率（n=1.515）和玻璃的折射率（n=1.52）,因此可增加进入透镜的光线，使视野亮度加强。2.在油镜头上常有下列几种标记：①放大倍数是90×或100/；若镜筒的长度不变，显微镜的放大倍数=目镜倍数乘以物镜的倍数。②镜头下缘有一白色线圈或黑色线圈；③刻有“油”或外文“HI”、“Oel”、“Oil”等字样。④油镜头的长度大于低倍镜和高倍镜。3.使用方法①对光转动转换器，将低倍镜镜头（4倍、10倍）转至载物台中央透光孔位置，打开透光光阑，对光，直至目镜中出现光线最明亮、最均匀的视场为止。显微镜的光源可分为内置光源和外置照明。内置光源：接通电源，按下底座的开关，电源打开即可。外置光源：将光圈放到最大位置，在用眼睛观察目镜的同时，转动反光镜使其朝向光源（自然光或灯光），PDFcreatedwithFinePrintpdfFactoryProtrialversion使视野中的光线最明、均匀。如靠近光源，可用平面反光镜，如距光源较远，可用凹面反光镜。根据所观察的标本，升降集光器和缩放光圈，以获最佳光度。一般染色标本用油镜检查时，光度宜强，可将光圈开足，集光器上升至与载物台相平；检查未染色标本用低倍镜或高倍镜观察时，应适当缩小光圈，下降集光器，使光度减弱。②装片将标本片放置在工作台的夹持器中，用夹持起移动标本片至工作台开口中心（透光孔处）。③调节焦距通过旋转粗调焦手轮，将载物台升到最高限定位置（制片不能触到物镜），此时已准备好调焦。使用4倍或10倍物镜，在目视目镜的同时，旋转粗调手轮，使工作台缓慢下降，在目视目镜中观察到的清晰的图像时，再调节光阑聚光镜孔，选择与物镜相匹配的孔，调节微调焦手轮，使视野中的图像最清晰。用低倍镜找出标本的范围，然后提高镜筒，在标本的待检部位加一小滴香柏油，慢慢将油镜头浸于油中，但勿接触玻片。然后，自目镜处一面观察，一面微转动粗调节器，使镜筒徐徐上升，待看到模糊物象时，改用细调节器调至物象清晰。如果是滴片标本，先滴一滴标本在玻片上，轻轻盖上盖玻片。加盖玻片时，先将盖玻片的一边与在玻片上的水滴边缘接触，然后自一侧轻轻放下，先在低倍镜下观察，然后在高倍镜下观察，通过改变光圈的大小或转动细调焦手轮。④还镜观察完毕把镜头和载玻片上的油用3%乙醚擦净。将低倍镜转成八字型.降下聚光器,转动粗调节器,使镜台下移,以免接物镜与集光器相碰受损。罩上镜套，放回原处。（宋文剑）PDFcreatedwithFinePrintpdfFactoryProtrialversion【实验目的、要求】掌握细菌涂片标本的制作、革兰氏染色法及口腔菌群的检测；熟悉细菌基础培养基的制备；高压蒸汽灭菌器的使用方法及注意事项；了解微生物的分布及其与人类的关系。【实验内容】1、齿垢涂片的革兰氏染色法。2、细菌基础培养基的制备。3、高压蒸汽灭菌器的使用。【实验学时】3学时一、革兰氏染色法【原理及方法】微生物的细胞小且透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。(注：任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。)细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。影响染色的其它因素，还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性，如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否，在染色上都起一定作用。此外，培养基的组成、菌龄、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等，也都能影响细菌的染色。微生物染色方法一般分为单染色法和