病原生物学与免疫学实验指导

LaboratoryManualofPathogenicBiologyandImmunology病原生物学与免疫学实验指导(五年制临床医学专业使用)大连医科大学病原生物学实验室2007年9月目录病原生物学与免疫学实验的目的和要求……………………………………1病原生物学与免疫学实验室规则……………………………………………2第一部分病原生物的形态学观察实验一细菌形态学观察……………………………………………………4实验二线虫的形态学观察…………………………………………………20实验三细菌的人工培养法…………………………………………………30实验四吸虫、绦虫的形态学观察…………………………………………53第二部分免疫学综合性实验实验五机体的免疫功能检测………………………………………………67第三部分综合性实验：临床标本的病原学检测实验六各种原虫的鉴别、粪便标本中寄生虫的检测……………………83实验七脓汁标本中细菌的分离鉴定………………………………………101实验八粪便标本中肠道致病菌的分离鉴定(1)……………………………114实验九粪便标本中肠道致病菌的分离鉴定(2)……………………………121实验十咽喉含漱液流感病毒的分离与鉴定………………………………124第四部分病原生物学与免疫学综合性试验实验十一免疫功能低下与机会性感染……………………………………137第五部分病原生物的免疫学检测实验十二间接血凝法检测杜氏利什曼原虫特异性抗体、对流免疫电泳检测脑膜炎球菌可溶性抗原…………………145实验十三酶联免疫吸附试验检测血吸虫可溶性虫卵抗原、HBsAg……162第六部分病原生物的分子生物学检测实验十四PCR法检测病原生物……………………………………………169病原生物学与免疫学实验目的和要求ObjectiveandRequestofPathogenicBiologyandImmunologyExperiment1.实验前必须掌握与实验相关的医学微生物学、医学寄生虫学及医学免疫学基础理论,做好预习，明确实验目的与实验内容。2.在实验时,对操作的实验应按指导所列的步骤依次进行,仔细观察并认真记录实验结果或绘图；几人同做一项实验时,要注意分工协作,密切配合；对示教的实验要仔细观察,并联系有关理论进行积极思考；设计性实验严格按照科研程序完成;实验中注意科学合理地分配和运用时间。在实验过程中做到三严：严肃、严格、严谨。如实记录实验结果，按规定完成实验报告。对于失败实验结果要分析原因，必要时重复实验。3.实验完毕,应认真分析实验结果,探讨实验原理,得出可能的结论。若实验结果与理论不符合时,要加以分析讨论,以逐步提高自己的科学思维能力。实验课后,须按时按要求递交实验报告。4.防止发生各种事故。5.严格遵守实验室规则。1病原生物学与免疫学实验室规则RulesofPathogenicBiologyandImmunologyLab1．进入实验室必须先穿本室的实验服,必要的实验指导,书籍和文具带入后,应放在实验台下的抽屉里,其它个人物品如书包,衣物等一律不得带入实验室。无菌操作时必须戴帽子和口罩。2.实验室内禁止饮食,吸烟,用嘴湿润铅笔或标签,以手抚摸头面部等等行为。3.每项微生物学实验,都要坚持无菌操作,既要防止临床标本及纯培养物被污染,更要防止临床标本或纯培养中的病原微生物感染人体或污染环境。4.用过的吸管,滴管,试管,玻片等带菌器材,应放在指定的地方或含消毒液的容器内,不得放在桌面上或水池内,亦不得将带菌液体倾入水槽。酒精灯不可互相点燃,以防发生意外。5.实验过程中若不慎将传染性标本污染桌面、手及其他物品时，应立即报告老师紧急处理，不得擅自处理。常见处理如下：（1）皮肤破伤：先除尽异物，用无菌生理盐水洗净后，涂以2%红汞或2%碘酒，必要时进行包扎。（2）灼伤：涂以凡士林油，5%鞣酸或2%苦味酸。（3）化学药品腐蚀伤：若为强酸，先用大量清水冲洗，再以5%碳酸氢钠或氢氧化铵溶液洗涤中和之；强碱腐蚀伤，则先以大量清水冲洗后，再用5%醋酸或5%硼酸溶液洗涤中和之。若受伤部位是眼部，经过上述步骤处理后，昀后滴入橄榄油或液体石腊1、2滴，滋润之。（4）吸入病菌菌液：应立即吐入盛有消毒液的容器内消毒，并用1：1000高锰酸钾漱口；根据菌类不同，必要时需服药预防。2（5）细菌污染衣物：应立即脱下，放入3%来苏尔或3%氯胺液内浸泡半小时，或仔细包好经高压蒸汽消毒后清洗。（6）菌液污染桌面：倾倒适量2-3%来苏尔或0.5%84消毒液于污染处，浸泡半小时后抹去。若手上沾有活菌，应浸泡于上述消毒液10-20分钟后，再以肥皂水冲刷之。6.不可擅自搬动示教,实验器材或室内设施.爱护公物,节约使用实验材料.如有损坏,应立即向指导教师报告,主动在破损物品登记本上登记,某些物品需按规定酌情赔偿。7.实验完毕,应清理桌面,把用过的物品放回原处(如显微镜,接种环,染色液,擦镜纸,香柏油,火柴等),需培养的物品按要求放入温箱。8.离开实验室前,应脱下实验服,反折放入抽屉内,在消毒液中将手浸泡5～10分钟,并用自来水冲洗干净后,方可离室。9.值日生负责整理清洁实验室(包括桌面、地面、实验设备等),然后关好水、电、门、窗,脱衣洗手后离室。10.未经许可,不得将实验室内任何物品(特别是菌种)带出室外。3第一部分病原生物的形态学观察PartIMorphologicalExaminationofPathogeny病原生物的形态是病原生物重要的特征之一，从人体、动物体或自然界中分离出病原生物可供传染病的诊断或流行病学分析，这是防治传染病的重要的理论依据。鉴定病原生物的种类是一项较复杂的工作，需要进行综合鉴定，但形态特征的观察是关键的一步。因为了解了病原生物的形态特征，可使分析范围大大缩小，甚至有一些病原生物根据形态即可作初步诊断。对病原生物进行形态观察要解决二个问题：一些很小的病原生物，需要放大方能观察，因而显微镜是不可缺少的仪器；又因为病原生物是半透明的，反差很小，必须染上颜色才能清楚地观察到其大小、形状，结构及染色反应等特点。实验一细菌形态学观察EXP.1MorphologicalExaminationofBacteria【实验目的、要求】1．掌握细菌形态描述方法，特殊构造及其在临床诊断中的实验意义；2．掌握细菌涂片的制备，革兰氏染色方法、步骤、原理及应用；3．掌握油镜的使用。【实验内容】1．显微镜（油镜）的使用2．基本形态与特殊构造的观察（球菌、杆菌、弧菌、鞭毛、芽胞、荚膜）3．不染色标本检查法（悬滴法、压片法，示教）4．细菌涂片制备及革兰氏染色法【实验学时】4学时一、细菌的形态观察各种细菌在一定条件下，均维持一定的形态和结构。细菌的形态与结构是鉴别细菌种类的根据之一，细菌结构又与其致病性强弱，免疫发生机理均有一定关系。4【材料】１．显微镜２．观察标本（１）球菌：葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、淋球菌涂片染色标本（２）杆菌：大肠杆菌、枯草杆菌、破伤风杆菌涂片染色标本（３）弧菌：霍乱弧菌染色标本（４）荚膜：肺炎双球菌荚膜染色标本（５）鞭毛：变形杆菌鞭毛染色标本（６）芽胞：破伤风杆菌芽胞染色标本（7）异染颗粒：白喉杆菌染色标本【方法】在玻片标本的正面，滴加镜油，用油镜（见附录）观察。１．注意观察细菌基本形态，比较其形状、大小排列及染色性。２．注意鉴别别细菌特殊结构：（１）荚膜的特点，如大小、颜色与菌体的关系。（２）鞭毛的特点，如鞭毛的形态，数目及其位置。（３）观察芽胞，注意芽胞的形状、颜色及位置。３．左眼观察标本的同时，右眼将图画在实验报告纸上，并加以适当地描述。【结果】1．葡萄球菌：革兰阳性（紫色），球形，常呈葡萄串状排列。2．链球菌：革兰染色阳性（紫色），菌体呈球形或卵圆形，链状排列。3．淋球菌：革兰氏染色阴性（红色），常成双排列，两球菌的接触面平坦，于染色标本中形似一对咖啡豆。4．大肠杆菌：革兰阴性（红色），为两端钝园的短杆菌，散在排列。5．霍乱弧菌：革兰阴性（红色），菌体只有一个弯曲，呈逗点状，散在排列。6．变形杆菌鞭毛染色，可见变形杆菌菌体呈紫红色，周身鞭毛呈红色。7．肺炎球菌（革兰染色），可见肺炎球菌为革兰阳性球菌，成双排列，5菌体周围有一未着色的环状带，即为荚膜。用特殊染色（荚膜染色）法可使荚膜着色。本次观察标本为赫斯（Hiss）氏荚膜染色法，菌体与背景均呈紫色，荚膜为淡兰色。8．破伤风梭菌（革兰染色），可见破伤风梭菌为革兰阳性杆菌，菌体顶端可见一个比菌体大的园形未着色空泡，此即为芽胞，整个菌体呈鼓槌状。9．白喉杆菌（Albert染色）：可见菌体呈绿色，异染颗粒为蓝黑色。【实验报告】图示细菌基本形态及特殊结构，并加以适当描述。二、细菌不染色标本检查法（示教）【原理】细菌不染色标本检查法适用于观察细菌的动力，形态大小和繁殖方式等。有鞭毛的细菌运动称真正运动叫固有运动，其特点是细菌从一个地方游到另一个地方，可以改变位置，无鞭毛的细菌运动叫布朗运动，特点是，不能改变位置，只在局部闪动，是因液体分子的冲击，致使细菌在局部颤动，这种运动也称分子运动。【材料】（１）菌种：变形杆菌、葡萄球菌８～１２小时幼龄培养物。（２）凹玻片、盖玻片、凡士林。（３）显微镜。【方法】1．悬滴法（１）取洁净凹面玻片一张，在凹窝周围涂以凡士林（图1-1）（２）取一环变形杆菌或葡萄坏菌培养物，放于干净的盖玻片中央。（３）将涂凡士林的凹面载物片反转（凹向下），凹窝对准盖玻片的菌液滴置于其上，粘住盖玻片后再反转凹面载片（此时液滴悬于盖玻片下）用接种环柄轻压盖片周围，使与凹窝边缘粘紧。（４）凹面载片置于镜台上，先以低倍物镜观察（聚光器下降，使视野稍暗）找到液滴边缘后，将边缘移到视野中央，再换高们物镜观察，上6下转动微螺旋，即可看到在较暗的视野中有反光较强的闪动或流动的菌体。图1-1悬滴法（正面及侧面）2．压滴法（1）用接种环取菌液置于洁净的载物玻片中央。（２）将擦净的盖玻片置于菌液上，覆盖时，先用盖片一边接触菌液（或先使中央与液滴接触）缓缓放下盖片，防止玻片间产生气泡（否则视野过高影响观察结果）滴加菌液量以覆盖片后无菌液溢出盖片为度。（３）将载片置于镜台上，用低倍物镜找到标本，再换高倍物镜观察。【结果】变形杆菌有鞭毛，有改变位置的运动，即真正运动。葡萄球菌无鞭毛，只在局部闪动，即布郎运动。【注意事项】1．观察悬滴标本时，先用低倍镜找到悬滴的边缘，然后将视野移至悬滴中央，将集光器下降，缩小光圈，使亮度减弱，再用高倍镜观察，否则亮度太强，不好观察。2．调节螺旋时，切忌过度下旋，以免压碎盖玻片。三、细菌涂片的制备及革兰染色法【原理】由于细菌本身无色半透明，其折光性和周围环境差别不大，未经染色不易观察其形态及结构。故需通过染料使之着色，使经染色后的菌体与背7景形成明显的色差，以便在显微镜下清楚地观察其形态结构。因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。革兰染色法（Gramstain）是丹麦细菌学家革兰（ChristainGram）于1884年发明的，至今已逾百年，但仍在广泛使用，是细菌学中昀为经典的染色法。其基本过程是标本经固定后，先用结晶紫初染，再用革兰氏碘液媒染，然后用95%酒精脱色，昀后用石炭酸复红稀释液复染。此法可将细菌染成两大类：不被酒精脱色仍保留紫色的为革兰氏阳性菌，被酒精脱色后复染成红色的为革兰氏阴性菌。革兰染色法的原理尚不完全清楚，主要有三种学说：等电学说：革兰阳性菌等电点（PH2~3）比革兰氏阴性菌（PH4~5）低，一般染色时染液的酸碱度在Ph7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。通透性学说：革兰阳性菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。革兰氏阴性细菌细胞壁疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易