硕士论文-IgE核酸适体生物传感器的研究

东北农业大学硕士学位论文IgE核酸适体生物传感器的研究姓名：徐大炜申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：刘皙洁;许丹科20060620IgE核酸适体生物传感器的研究作者：徐大炜学位授予单位：东北农业大学相似文献(4条)1.学位论文姚春艳适配子型压电石英晶体传感器的构建及其与抗体型压电免疫传感器的比较研究2008目的：通过建立压电石英晶体振荡频率检测平台，利用适配子作为压电生物传感器的生物识别分子，构建适配子型压电石英晶体生物传感器，并用其对人免疫球蛋白E进行检测，对各项检测参数进行研究，并与抗体型压电免疫生物传感器进行比较。方法：1.利用精细微加工工艺制作的石英晶体作为换能器，并在此基础上制备生物传感器微阵列，以构建压电石英晶体生物传感器检测平台。2.采用生物素-亲和素法将抗人免疫球蛋白适配子固定于石英晶体表面，用于人免疫球蛋白E的标准血清及临床标本的检测。根据频率变化和IgE浓度之间的关系绘制标准曲线。3.探索适配子型压电生物传感器进行实际检测的准确性、最低检测限等检测参数，并对其非特异结合反应、再生条件、保存时间等进行研究。4.分别用适配子型压电生物传感器和抗体型压电免疫传感器对IgE标准品和血清标本进行检测，并对两者的检测范围、最低检测限、检测时间、非特异性结合实验、再生实验、保存实验等进行研究，以比较适配子型压电生物传感器和抗体型压电免疫传感器进行实际检测的优越性。结果：1.所构建的适配子型压电生物传感器的检测范围为2.5-200μg/L，最低检测值为3ug/L，与化学发光法相比相关系数为0.992，具有良好的检测性能。2.适配子型压电生物传感器对BSA、HSA、IgG、IgM等干扰蛋白的检测信号显著低于特异性IgE的检测信号(＜5％)。3.在选用的再生试剂中，EDTA表现了最好的再生效果，适配子芯片经过10次再生后仍可保留80％的生物学活性。4.对适配子芯片进行保存实验，在7天内稳定性几乎没有改变，随后稳定性逐渐下降，3周后检测活性约为初始检测的90％。5.适配子型压电生物传感器和抗体型免疫传感器均可在15min内完成检测，都具有良好的检测灵敏度、线性范围和特异性，准确性与化学发光法相当，对结果进行回归分析吻合性较好。6.适配子型生物传感器的再生和保存性能优于抗体型免疫传感器。结论：1.所构建的适配子型压电生物传感器和化学发光法进行人血清标本IgE检测的相关系数为0.992。适配子型压电生物传感器可以对复杂生物样本中的IgE进行高灵敏度、高特异性的检测。2.适配子型压电生物传感器和抗体型免疫传感器均可在15分钟内完成对IgE的检测，可为患者提供更快速的诊断，同时操作更加简便。与传统的检测方法相比，传感器方法具有无需标记，无需对标本进行预处理的特点。3.适配子型压电生物传感器在最低检测限、结合特异性及准确性方面均优于抗体型免疫传感器。4.适配子型压电生物传感器具备优良的再生和保存性能，可进一步降低临床检测应用中的成本。5.适配子型压电石英晶体传感器作为一种新型生物传感器，具有快速、灵敏、实时检测、无需标记等优点，因此具有重要的科学意义和广阔的应用前景。2.学位论文齐永志适配子型压电石英晶体传感器的实验研究2007目的：对自行研制的压电石英生物传感器检测平台及其分析软件进行改进，并选择合适的核酸探针固定方法将适配子固定在传感器金膜表面，以此建立适配子型压电传感器阵列，检测人免疫球蛋白E，对适配子型压电石英传感器的各项参数进行初步探索。方法1．利用精细微加工法制作石英晶体，在其表面光刻金膜电极，石英晶体AT切型、13×13mm、基频10MHz、金膜电极直径4.0mm，与检测池组装后形成传感器检测单元，传感器检测单元在检测仪上构成2×5型拔插式传感器阵列。频率记录分析软件从PESA-2.0升级到PESA-4.0，新软件采用VisualC++语言设计，增加多项功能使其更适用于实验研究和临床检测的需要。对构建好的压电传感器检测平台进行气液相稳定性实验及阵列检测稳定性实验。2．用3，3'-二巯基丙酸自组装方法将亲和素固定在压电石英晶体传感器金膜表面，通过压电石英传感器频率变化反映亲和素固定效果，比较不同浓度、不同pH值条件下亲和素固定引起的频率变化，经SPSS软件进行单因素分析选择最佳固定条件。3．用巯基固定法及生物素-亲和素固定法将针对人IgE的适配子探针固定在压电传感器的金膜表面，通过压电传感器对适配子与IgE的反应进行实时监测，观察不同浓度IgE的反应趋势及所引起的频率变化，经独立样本T检验确定两种方法的优劣。4．用生物素一亲和素法固定IgE适配子对不同浓度IgE进行检测，获得IgE检测标准曲线，以PBS空白对照三倍标准差反查检测标准曲线，得到最低检出限。通过检测BSA、IgG、IgE非特异信号，并与特异性信号相比较对适配子检测的特异性进行检验。分别用HCL、NaOH、EDTA、尿素、甲酰胺五种试剂对适配子芯片进行再生实验，选取较好再生试剂。将固定好的适配子芯片保存在PBS缓冲液(0.1％叠氮钠)中，对芯片的保存时间进行测定。结果1．AT切型石英晶体液相起振能力强、频率稳定适合压电生物传感器检测要求，传感器组装后，气、液相检测稳定性好，调稳后10分钟内气相频率变化不超过±lHz、液相不超过±2Hz。2．构建的传感器阵列，单个传感器拔插对阵列中其它传感器无明显影响，多通道同时检测稳定性好无相互干扰，传感器阵列稳定性达到实验要求。3．为了满足临床检测的需要，新编PESA-4.0软件增加了如病人信息录入、历史结果查阅、曲线拟合、定标等多项功能，其中频率自动更新和图像编辑等功能的添加对实验室研究也有较大帮助。4．经单因素方差分析，磷酸盐缓冲液pH值为6.2时亲和素固定引起的频率变化与pH5.8、pH6.6时并无明显差异(P0.05)，但pH值为6.2时频率下降有最大均值，应用pH7.0、pH7.4溶液进行亲和素固定时频率改变显著减小(P0.01)，浓度为0.2mg/ml时亲和素固定已达饱和。5．两种方法固定适配子对IgE进行检测，巯基法明显不适合于适配子探针固定，表现在对IgE检测实时监测反应趋势不明显，低浓度检测信号响应差，线性范围窄，同浓度检测重复性差；与巯基法相比，经优化的亲和素法对适配子探针固定效果好，检测结果显示在上述各个方面均优于巯基法。6．亲和素法固定适配子对IgE进行检测，最低检出限0.055mg/L，线性范围0.1-2.5mg/L，非特异性信号响应小，不超过同浓度特异性信号的5％。用EDTA对适配子芯片进行再生效果最好，重复检测五次后芯片响应信号仍在第一次检测的90％以上，此外HCL也可对适配子芯片重复利用三次。固定好的适配子芯片在加入防腐剂的结合缓冲液中可长期保存，保存21天后信号响应无明显下降。结论1．构建的压电生物传感器检测阵列在液相中起振能力强，多通道检测频率稳定相互无影响，可以应用于包括适配子在内的多种识别分子检测。为临床检测开发的PESA-4.0分析软件对实验研究也有较大帮助。2．选用pH6.2的0.2mg/ml亲和素进行压电石英晶体传感器金膜修饰效果最好。3．由于适配子检测与普通核酸探针检测存在差异，在普通探针固定中效果较好的巯基法明显不适合于适配子探针固定，生物素-亲和素法是压电传感器金膜表面适配子固定的理想方法。4．适配子压电传感器检测取得了较好的结果，检出限低且非特异性信号小，显示该平台在蛋白检测中有较好的应用前景。5．与抗体压电传感器相比较，适配子压电传感器有一定优势，适配子芯片成本更低，再生能力强，固定好的芯片保存时间长，体现出适配子检测的优越性。3.会议论文何婧琳.吴再生.张松柏.沈国励.俞汝勤基于非标记DNA核酸适体的高灵敏IgE荧光传感器检测研究2008本文研制了一种基于DNA核酸适体(aptamer)的荧光传感器,用于免疫球蛋白E(IgE)的检测。标记德克萨斯红的短链DNA(T—DNA)与部分IgE的aptamer序列互补配对,从而在绑定IgE后体系的荧光信号增强。另外一条标记了dabcyl猝灭基团的短链DNA(Q-DNA)与紧挨T-DNA结合位点的IgEaptamcr序列互补,以降低背景荧光。IgE能够被检测到的线性范围是9.2x10-11到3.7x10-8mol.L-1,检测下限是5.7x10-11mol.L-1。4.学位论文封科军基因检测和点突变识别的DNA探针及适配体生物传感新方法研究2008随着人类基因组计划的完成和功能蛋白质组学的研究进展，建立简单、灵敏、快速、特异性强、高通量的蛋白质和基因检测方法，已成为分析科学家们研究的重点之一。核酸碱基的突变与人类许多疾病有着直接的关系，因此实现单核苷酸突变准确灵敏的检测对疾病的早期诊断也有着重要的意义。核酸适配体是近年来发展起来的一类经体外人工进化程序筛选出的寡聚核苷酸。由于其不但和抗体一样能与配体高效、特异性地结合，而且具有许多抗体无法比拟的优点，因此将核酸适配体应用于生物传感器实现对包括蛋白质、小分子等目标物的检测有着巨大的发展潜力。鉴于电化学及压电检测技术所需仪器简单、检测成本低、易于实现微型化，且灵敏度较高等优点，本研究论文针对当前传感器设计中的探针固定化和检测方法两个关键技术，在电化学及压电DNA传感器用于基因检测和点突变识别以及电化学适配体传感器两方面开展了一些新方法研究工作。具体内容如下：(1)在第2章中，研制出一种新型的基于纳米多孔CeO2/壳聚糖复合膜的固定基质。用它来固定单链DNA探针，构建了检测与结肠癌高度相关的基因序列的电化学DNA生物传感器。该固定基质制备方法简单，成本低，结合了CeO2和壳聚糖的优点，具有良好的生物兼容性，无毒性和优越的电子传导性。将其用于固定结肠癌基因的互补探针序列，能够显著增强ssDNA探针在电极表面的负载量。制得的传感器检测目标的线性范围在1.6×10-11-1.2×10-7M，检测下限为1.0×10-11M，具有识别完全互补目标序列和四碱基错配序列的能力。(2)在第3章中，基于连接酶的高保真性和生物催化沉积反应，提出了用于高特异性识别单碱基突变的压电检测方法。实验中，目标DNA链先与连接在石英晶振上的DNA捕获探针杂交，再与生物素标记的等位特异性DNA检测探针杂交。只有在目标DNA链和检测探针完全匹配时，连接反应才能发生，即将捕获探针和检测探针相连接。否则，即使只有一个等位错配的基因，连接反应也不会发生。经过高温热处理，形成的双链解开，只有与目标链完全匹配的检测探针保留在电极表面。生物素化的检测探针继而与链酶亲和素化的辣根过氧化物(SA-HRP)绑定，辣根过氧化物催化过氧化氢氧化底物中的3，3-二氨基联苯胺(DAB)在电极表面生成不溶性沉淀物，使压电频率响应显著增大。用该方法对β-地中海贫血基因-28位密码子的突变情况进行了检测，使突变型和野生型得到了很好的区分，对目标的检测线性范围为0.7-100nM，检测下限达0.1nM，是一个低成本高效率的检测方法。(3)在第4章中，基于等位基因特异性延伸法，结合酶催化银沉积的放大体系，提出了用于单碱基突变的电化学检测方法。首先，在金电极表面固定的等位特异性捕获探针。由于其与野生型目标链完全互补，在聚合酶的作用下能够发生延伸反应；而突变型目标链由于3’端与捕获探针发生错配，延伸反应不能进行，从而实现对突变型和野生型基因的区分。用1MNaOH进行解链处理后，双链结构解开，目标链从电极表面脱落。在电极表面滴加与探针延伸部分相互补的生物素化的检测探针后，只有发生延伸反应的捕获探针链会进一步与生物素化的检测探针杂交，并引入链亲和素化的碱性磷酸酶，继而发生酶催化沉积银的反应。通过线性扫描伏安法可以检测出电极表面沉积的银。该方法成功用于β-地中海贫血基因-28位密码子单碱基突变的区分和定量检测，简单、快速、灵敏度高，线性范围为3.0×10-16-3.0×10-8M，检测下限为1.0×10-16M。(4)在第5章中，报道了基于目标物诱导置换适配体的无标记电化学传感器，用于以腺苷为分析物模型的目标物检测。该传感器使用1，6-巯基