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明睿生物卓越服务WB技术要点和常见问题分析WB过程中常见的问题及可能原因分析问题可能原因验证或解决办法1.转膜不充分膜没有完全均匀湿透使用100%methanol浸透膜靶蛋白分子量小于1W选择小孔径的膜，缩短转移时间靶蛋白等电点接近或等于转移缓冲液pH值可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液甲醇浓度过高过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替转移时间不够对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间2.背景高膜没有完全均匀湿透使用100%methanol浸透膜洗膜不充分增加洗液体积和洗涤次数阻断不充分增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）二抗浓度过高降低二抗浓度检测过程中膜干燥保证充分的反应液，避免出现干膜现象曝光过度缩短曝光时间抗体与阻断蛋白有交叉反应检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应3.没有阳性条带抗体染色不充分增加抗体浓度，延长孵育时间酶失活直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。试剂不匹配一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性一抗失效选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液HRP抑制剂所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠4.有阳性条带，但条带比较弱抗体染色不充分增加抗体浓度，延长孵育时间酶活性降低直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物标本中靶蛋白含量太低增加标本上样量。洗膜过度缩短洗涤时间HRP抑制剂所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠抗体活性降低选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置蛋白转移不充分见上述封闭过度减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型曝光时间过短延长曝光时间5.条带位置（大小）不对；或有非特异性条带二抗的非特异性结合增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）一抗的特异性不够使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性蛋白降解使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂二聚体或多聚体存在增加蛋白质变性过程及强度抗体浓度过高降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带蛋白上样量过大降低上样量6.背景有斑点封闭剂中有聚集体使用前过滤封闭试剂HRP耦联二抗中有聚集体过滤二抗试剂，去除聚集体7.膜上出现反像（暗背景上白色带）HRP含量过高降低酶联二抗的浓度明睿生物卓越服务