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第45讲生物技术在其他方面的应用[考纲要求]1.PCR技术的基本操作和应用。2.蛋白质的提取和分离。3.实验：DNA的粗提取与鉴定。考点一DNA的粗提取与鉴定1．基本原理2．操作过程材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织――→破碎细胞以鸡血为例：鸡血细胞，加蒸馏水，用玻璃棒搅拌，用纱布过滤，收集滤液去除杂质：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质――→DNA析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的体积分数为95%的酒精溶液DNA的鉴定：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，沸水中加热5min，溶液变成蓝色易错警示(1)本实验不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟红细胞无细胞核。可选用鸡血细胞作材料。(2)实验中两次使用蒸馏水，第一次的目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出DNA，第二次的目的是稀释NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。1．下图表示以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取与鉴定的操作程序，请分析回答下列问题：(1)步骤一中，向鸡血细胞液中加入____________并搅拌，可使鸡血细胞破裂。(2)步骤二中，过滤后收集含有DNA的____________。(3)步骤三、四的操作原理是________________________________________________________________________________________________________________________；步骤四中，通过向溶液中加入____________调节NaCl溶液的物质的量浓度至____________mol/L时，DNA将会析出，过滤去除溶液中的杂质。(4)步骤七：向步骤六过滤后的____________中加入等体积的冷却的____________，静置2～3min，溶液中会出现________色丝状物，这就是粗提取的DNA。(5)步骤七：DNA遇____________试剂，沸水浴5min，冷却后，溶液呈______色。答案(1)蒸馏水(2)滤液(3)DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质蒸馏水0.14(4)滤液酒精白(5)二苯胺蓝解析破碎红细胞应用蒸馏水，使之吸水涨破。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2mol/L的NaCl溶液中DNA溶解，在0.14mol/L的NaCl溶液中DNA析出。可通过加入蒸馏水将2mol/L的NaCl溶液稀释为0.14mol/L的NaCl溶液。DNA不溶于冷酒精，遇二苯胺加热呈蓝色。1．DNA与蛋白质在NaCl溶液中溶解度比较2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液溶解规律DNA溶解析出蛋白质部分发生盐析沉淀溶解NaCl溶液从2mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大2．DNA粗提取与鉴定中不同试剂的用途及原理比较试剂浓度用途原理(“△”为实验的主要原理)NaCl溶液2mol/L溶解DNADNA在NaCl溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变，溶解度在2mol/L时最大、在0.14mol/L时最小△0.14mol/L析出DNA2mol/L鉴定时的溶剂酒精95%(体积分数)除去杂质以提纯DNADNA不溶于酒精，但是细胞中的某些物质可以溶于酒精△二苯胺鉴定剂DNA遇二苯胺(沸水浴)会变蓝色△柠檬酸钠0.03g/mL抗凝剂除去血液中的钙离子，防止血液凝固3．DNA粗提取实验材料和方法的选择(1)不同生物的组织中DNA含量不同在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。(2)材料不同所采用的提取方法不同①植物组织：取材→研磨→过滤→沉淀。②鸡血：制备鸡血细胞液→提取核DNA→溶解细胞核内DNA→析出并滤取DNA→DNA再溶解→提取较纯净的DNA。考点二PCR技术的基本操作和应用1．PCR原理DNA热变性原理，即：2．PCR反应过程(1)变性：当温度上升到90_℃以上时，双链DNA解聚为单链。(2)复性：温度下降到55_℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)延伸：温度上升到72℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。易错警示(1)DNA分子复制的人工控制解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。复制条件：缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶和两种引物。反应场所：PCR仪。(2)PCR技术中的引物：①含义：引物是一小段单链DNA或RNA分子。②作用：为DNA聚合酶提供合成的3′端起点。③种类：扩增一个DNA分子需要2种引物。④数目：引物数目等于新合成的DNA子链数目。⑤与DNA母链的关系：两种引物分别与DNA母链的3′端通过碱基互补配对结合。2．多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列有关PCR技术的基本原理及应用问题：(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将________________的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的____________开始延伸DNA链。(2)PCR利用DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到__________________________________，它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫______________。(3)PCR的每次循环可以分为______________________三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有________个这样的DNA片段。(4)请用简图表示出一个DNA片段PCR反应中第二轮的产物。(5)简述PCR技术的主要应用。________________________________________________________________________________________________________________________________________________。答案(1)磷酸基团3′端(2)耐高温的TaqDNA聚合酶选择培养基(3)变性、复性和延伸32(4)如图所示(5)遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定(要求3项以上)解析(1)DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已经存在的核酸的3′羟基上，与DNA母链结合的引物就提供这个羟基。(2)因PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，所以用于催化DNA复制过程的DNA聚合酶要具有耐高温的特性。用选择培养基可将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来。(3)DNA复制时两条链均作为模板，进行半保留复制，所以复制5次后得到的子代DNA分子数为25＝32个。(4)新合成的DNA链带有引物，而最初的模板DNA的两条链不带有引物。(5)PCR技术可以对DNA分子进行扩增，所以可用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等方面。1．细胞内DNA复制与PCR技术的比较细胞内DNA复制PCR不同点解旋在DNA解旋酶作用下，边解旋边复制80～100℃高温解旋，双链完全分开酶DNA解旋酶、DNA聚合酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA温度体内温和条件高温相同点①需提供DNA复制的模板②四种脱氧核苷酸为原料③子链延伸的方向都是从5′端到3′端2．PCR的反应过程(1)变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，如下图：(2)复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：(3)延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：考点三血红蛋白的提取和分离1．血红蛋白的提取和分离原理及方法(1)原理：蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。(2)分离方法①凝胶色谱法：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。②电泳法：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。常用的电泳法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。2．血红蛋白的提取和分离过程样品处理：红细胞的洗涤―→血红蛋白的释放―→分离血红蛋白溶液――→粗分离：用透析法除去样品中相对分子质量较小的杂质纯化：用凝胶色谱法分离相对分子质量不同的蛋白质3．判断正误(1)利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量小的先洗脱出来()(2)在电泳过程中，蛋白质分子的移动速度，与分子本身的大小和形状无关，而与所带电荷的差异有关()(3)在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中，电泳迁移率完全取决于分子的大小()易错警示“血红蛋白的提取和分离实验”中的注意事项(1)红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少，否则无法除去血浆蛋白；要低速、短时离心，否则会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。(2)凝胶的预处理：用沸水浴法不但节约时间，而且除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。(3)色谱柱的装填：装填时尽量紧密，减小颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。(4)色谱柱成功的标志：红色区带均匀一致地移动。3．红细胞中含有大量的血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验来提取和分离血红蛋白。下列对血红蛋白提取和分离的叙述，错误的是()A．血红蛋白提取和分离一般按照样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定的顺序进行B．纯化过程中要用生理盐水充分溶胀凝胶来配制凝胶悬浮液C．粗分离中透析的目的是去除相对分子质量较小的杂质D．可经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定1．常用的蛋白质分离方法(1)凝胶色谱法蛋白质项目相对分子质量大相对分子质量小凝胶内部不能进入能进入运动方式垂直向下垂直向下和无规则扩散运动经过路程较短较长洗脱次序先流出后流出(2)电泳法原理①在一定pH下，蛋白质分子的某些基团解离后带上正电或负电。在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。②由于待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。2．分离DNA、PCR技术、分离蛋白质的比较分离DNAPCR技术分离蛋白质实验原理DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，且不溶于冷酒精利用DNA热变性原理体外扩增DNA依据相对分子质量的大小不同来分离蛋白质实验过程选取材料→破碎细胞释放DNA→除杂→DNA析出与鉴定变性→复性→延伸样品处理→凝胶色谱操作实验结果获得较纯净的DNA获得大量DNA相对分子质量不同的蛋白质得以分离实验意义为DNA研究打下基础解决了DNA研究中材料不足的问题为蛋白质的研究和利用提供了原材料3．比较琼脂糖凝胶电泳和SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)从载体上看，利用琼脂糖凝胶作为载体的是琼脂糖凝胶电泳，利用SDS—聚丙烯酰胺凝胶作为载体的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。(2)从依据上看，利用了分子带电性质差异和分子大小的是琼脂糖凝胶电泳，仅利用了分子大小的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。(3)从优点上看，琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需处理，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了净电荷对迁移率的影响，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。1．(2012·江苏卷，18)下列关于“DNA粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是()A．洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度B．将DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝C．常温下菜花匀浆中有些酶类会影响DNA的提取D．用玻璃棒缓慢搅拌滤液会